本發(fā)明涉及化學(xué)物質(zhì)生殖發(fā)育毒性，具體而言，涉及一種斑馬魚(yú)生殖毒性模型的構(gòu)建方法、評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、目前，評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖發(fā)育毒性的方法主要有：轉(zhuǎn)熒光蛋白基因動(dòng)物模型實(shí)時(shí)熒光動(dòng)態(tài)跟蹤法、斑馬魚(yú)麻醉后檢測(cè)雄性斑馬魚(yú)精子生成能力和雌性斑馬魚(yú)產(chǎn)卵能力評(píng)估、果蠅卵巢畸形評(píng)價(jià)。其中，采用熒光成像技術(shù)主要關(guān)注組織發(fā)育和/或早期胚胎著床和/或體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育毒性，需要取生物組織進(jìn)行切片觀察，不僅需要相應(yīng)的技術(shù)設(shè)備，而且需要犧牲試驗(yàn)動(dòng)物才能完成。但是斑馬魚(yú)麻醉存在操作復(fù)雜的問(wèn)題，需要在斑馬魚(yú)麻醉之后，擠壓性腺，取精子、卵子，并人工統(tǒng)計(jì)。麻醉、統(tǒng)計(jì)等過(guò)程花費(fèi)的時(shí)間較多，而且容易引入偶然誤差。
2、鑒于此，特提出本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供一種評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法及應(yīng)用以解決上述技術(shù)問(wèn)題。
2、本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：
3、第一方面，本發(fā)明提供了一種斑馬魚(yú)生殖毒性模型的構(gòu)建方法，其包括如下步驟：
4、將斑馬魚(yú)置于具有生殖毒性的化學(xué)物質(zhì)暴露環(huán)境下暴露；
5、具有生殖毒性的化學(xué)物質(zhì)選自甲基汞、生物堿毒素、雙酚類(lèi)或菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑；暴露環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)的濃度至少為0.5μg/l，在具有生殖毒性的化學(xué)物質(zhì)暴露環(huán)境下暴露的時(shí)間為14-42天；
6、優(yōu)選地，生物堿毒素為柱孢藻毒素(cylindrospermopsin，cas：143545-90-8)。
7、第二方面，本發(fā)明提供了一種評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法，其包括如下步驟：對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行求偶行為評(píng)價(jià)和生育力評(píng)價(jià)；
8、其中求偶行為評(píng)價(jià)包括:先將雌性和雄性斑馬魚(yú)置于具有生殖毒性的化學(xué)物質(zhì)暴露環(huán)境下暴露；然后取暴露后的雌性或雄性目標(biāo)斑馬魚(yú)置于求偶行為評(píng)價(jià)其中一個(gè)區(qū)域，相應(yīng)地取暴露后的雄性或雌性求偶行為測(cè)試斑馬魚(yú)置于求偶行為評(píng)價(jià)的另外一個(gè)區(qū)域；且目標(biāo)斑馬魚(yú)和測(cè)試斑馬魚(yú)的活動(dòng)區(qū)域不重疊，在一時(shí)間段內(nèi)拍攝斑馬魚(yú)行為學(xué)視頻和/或圖片；評(píng)估雄性斑馬魚(yú)和雌性斑馬魚(yú)在求偶期間的運(yùn)動(dòng)行為；
9、暴露環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)的濃度至少為0.5μg/l；求偶行為評(píng)價(jià)區(qū)域與暴露環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)的濃度相同；
10、求偶期間的運(yùn)動(dòng)行為選自如下至少一種：
11、求偶期間的測(cè)試斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)距離、測(cè)試斑馬魚(yú)進(jìn)入某一指定區(qū)域的總持續(xù)時(shí)間、進(jìn)入指定區(qū)域的頻率、求偶軌跡和求偶指數(shù)；指定區(qū)域是靠近目標(biāo)魚(yú)的區(qū)域；
12、生育力評(píng)價(jià)包括如下步驟：將在具有生殖毒性的化學(xué)物質(zhì)暴露環(huán)境下暴露后的雌性和雄性斑馬魚(yú)混養(yǎng)，然后對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行如下至少一種評(píng)價(jià)：對(duì)雌性斑馬魚(yú)的產(chǎn)卵量和/或受精率進(jìn)行評(píng)估、檢測(cè)雌性斑馬魚(yú)和/或雄性斑馬魚(yú)生殖相關(guān)激素水平；
13、優(yōu)選地，求偶期間的測(cè)試斑馬魚(yú)在指定區(qū)域的運(yùn)動(dòng)距離；
14、優(yōu)選地，暴露后的雌性和雄性斑馬魚(yú)混養(yǎng)的時(shí)間為7-28天。
15、在本發(fā)明應(yīng)用較佳的實(shí)施方式中，若在暴露環(huán)境中，斑馬魚(yú)的求偶行為下降，斑馬魚(yú)的生育力下降，則評(píng)估化學(xué)物質(zhì)對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生生殖毒性。
16、在本發(fā)明應(yīng)用較佳的實(shí)施方式中，雌性和雄性斑馬魚(yú)在具有生殖毒性的化學(xué)物質(zhì)暴露環(huán)境下暴露的時(shí)間為14-42天。
17、在本發(fā)明應(yīng)用較佳的實(shí)施方式中，拍攝斑馬魚(yú)行為學(xué)視頻和/或圖片的時(shí)間為10-20min；
18、在本發(fā)明應(yīng)用較佳的實(shí)施方式中，拍攝斑馬魚(yú)行為學(xué)視頻和/或圖片是在連續(xù)光照條件下進(jìn)行。
19、在本發(fā)明應(yīng)用較佳的實(shí)施方式中，利用軟件分析斑馬魚(yú)行為學(xué)視頻和/或圖片，獲得求偶期間的運(yùn)動(dòng)行為。
20、在本發(fā)明應(yīng)用較佳的實(shí)施方式中，求偶指數(shù)是指：雄性斑馬魚(yú)或雌性斑馬魚(yú)追逐另一只雌性斑馬魚(yú)或另一只雄性斑馬魚(yú)的時(shí)間。
21、在本發(fā)明應(yīng)用較佳的實(shí)施方式中，生殖相關(guān)激素選自睪酮、雌二醇或卵黃素。
22、在本發(fā)明應(yīng)用較佳的實(shí)施方式中，具有生殖毒性的化學(xué)物質(zhì)選自甲基汞、生物堿毒素、雙酚類(lèi)或菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑。生物堿毒素為柱孢藻毒素(cylindrospermopsin，cas：143545-90-8)。
23、第三方面，本發(fā)明還提供了上述模型構(gòu)建方法構(gòu)建的斑馬魚(yú)生殖毒性模型或評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法構(gòu)建的斑馬魚(yú)生殖毒性模型在篩選預(yù)防和/或治療生殖功能損傷的藥物中的應(yīng)用，應(yīng)用包括：按照上述的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法評(píng)估化學(xué)物質(zhì)對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生生殖毒性，獲得斑馬魚(yú)生殖毒性模型。
24、第四方面，本發(fā)明還提供了上述模型構(gòu)建方法構(gòu)建的斑馬魚(yú)生殖毒性模型或評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法構(gòu)建的斑馬魚(yú)生殖毒性模型在篩選改善或抑制斑馬魚(yú)的求偶行為異常的藥物中的應(yīng)用，應(yīng)用包括：按照上述的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法評(píng)估化學(xué)物質(zhì)對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生生殖毒性，獲得斑馬魚(yú)生殖毒性模型。
25、本發(fā)明具有以下有益效果：
26、本發(fā)明提供的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法可通過(guò)拍攝行為學(xué)圖片或視頻關(guān)注求偶行為變化，不需要犧牲試驗(yàn)動(dòng)物，也不需要專(zhuān)業(yè)的熒光成像儀器設(shè)備、組織切片設(shè)備；且更符合動(dòng)物倫理，節(jié)約成本，可以用同一批生物實(shí)現(xiàn)連續(xù)觀測(cè)，試驗(yàn)過(guò)程更加靈活。
27、測(cè)試求偶行為可快速利用軟件分析獲得斑馬魚(yú)行為變化，與傳統(tǒng)產(chǎn)卵統(tǒng)計(jì)方式相比可大大節(jié)約人力和時(shí)間，并且不需要對(duì)魚(yú)進(jìn)行任何麻醉處理；求偶行為指示生殖影響同樣是活體觀測(cè)，能夠支持同一批斑馬魚(yú)的長(zhǎng)期追蹤或者重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
28、相比于果蠅，本發(fā)明利用與人類(lèi)基因具87％相似性的斑馬魚(yú)作為模式生物，其生殖系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物差異較小，結(jié)果作為臨床和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估參考價(jià)值較高；本發(fā)明既檢測(cè)雌性的卵巢畸形還關(guān)注雄性生殖毒性，具有評(píng)價(jià)維度更多的優(yōu)勢(shì)。
29、基于本發(fā)明提供的方法可構(gòu)建斑馬魚(yú)生殖毒性模型，該模型可以作為斑馬魚(yú)的生殖功能損傷的藥物篩選平臺(tái)，通過(guò)觀察斑馬魚(yú)的求偶行為變化篩選潛在有效藥物。此外，利用斑馬魚(yú)的遺傳背景，有利于研究生殖功能障礙的分子機(jī)制，為未來(lái)的治療提供理論基礎(chǔ)。本發(fā)明的提出在醫(yī)學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)和天然活性成份篩選等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。
1.一種斑馬魚(yú)生殖毒性模型的構(gòu)建方法，其特征在于，其包括如下步驟：
2.一種評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法，其特征在于，其包括如下步驟：對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行求偶行為評(píng)價(jià)和生育力評(píng)價(jià)；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法，其特征在于，若在暴露環(huán)境中，斑馬魚(yú)的求偶行為下降，斑馬魚(yú)的生育力下降，則評(píng)估所述化學(xué)物質(zhì)對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生生殖毒性。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法，其特征在于，雌性和雄性斑馬魚(yú)在具有生殖毒性的化學(xué)物質(zhì)暴露環(huán)境下暴露的時(shí)間為14-42天。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法，其特征在于，所述拍攝斑馬魚(yú)行為學(xué)視頻和/或圖片的時(shí)間為10-20min；
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法，其特征在于，所述求偶指數(shù)是指：雄性斑馬魚(yú)或雌性斑馬魚(yú)追逐另一只雌性斑馬魚(yú)或另一只雄性斑馬魚(yú)的時(shí)間。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法，其特征在于，所述生殖相關(guān)激素選自睪酮、雌二醇或卵黃素。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)所述的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法，其特征在于，具有生殖毒性的化學(xué)物質(zhì)選自甲基汞、生物堿毒素、雙酚類(lèi)或菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑；
9.如權(quán)利要求1構(gòu)建的斑馬魚(yú)生殖毒性模型或如權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)所述的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法構(gòu)建的斑馬魚(yú)生殖毒性模型在篩選預(yù)防和/或治療生殖功能損傷的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括：按照權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)所述的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法評(píng)估所述化學(xué)物質(zhì)對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生生殖毒性，獲得斑馬魚(yú)生殖毒性模型。
10.如權(quán)利要求1構(gòu)建的斑馬魚(yú)生殖毒性模型或如權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)所述的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法構(gòu)建的斑馬魚(yú)生殖毒性模型在篩選改善或抑制斑馬魚(yú)的求偶行為異常的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括：按照權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)所述的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)生殖毒性的方法評(píng)估所述化學(xué)物質(zhì)對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生生殖毒性，獲得斑馬魚(yú)生殖毒性模型。