本申請屬于疫苗制備，尤其涉及一種卡介苗凍干制劑的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、卡介苗(bcg?vaccine)是由減毒牛型結(jié)核桿菌懸浮液制成的活菌苗，具有增強巨噬細胞活性，加強巨噬細胞殺滅腫瘤細胞的能力，活化t淋巴細胞，增強機體細胞免疫的功能。最早由法國科學(xué)家卡爾梅特(calmette)和介朗(guérin)研制成功，用于腫瘤的輔助治療；預(yù)防結(jié)核??；治療哮喘性支氣管炎及預(yù)防小兒感冒，也用于治療膀胱原位癌和預(yù)防復(fù)發(fā)，用于預(yù)防處于ta或t1期的膀胱乳頭狀瘤經(jīng)尿道切除術(shù)后的復(fù)發(fā)。
2、卡介苗被稱為“出生接種第一針”，目前，世界上多數(shù)國家都已將卡介苗列為計劃免疫必須接種的疫苗之一。卡介苗接種的主要對象是新生嬰幼兒，接種后可預(yù)防發(fā)生兒童結(jié)核病，特別是能防止那些嚴重類型的結(jié)核病，如結(jié)核性腦膜炎。接種卡介苗對兒童的健康成長很有好處。
3、由于卡介菌的生產(chǎn)需要嚴格控制培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基的成分、溫度、ph值、通氣量等；這些條件的微小變化都可能影響菌株的生長和代謝，進而影響疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量。并且，在大規(guī)模發(fā)酵過程中，如何保證發(fā)酵罐內(nèi)的均勻混合、氧氣傳遞以及代謝產(chǎn)物的及時排出是關(guān)鍵問題。不均勻的混合可能導(dǎo)致局部營養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧濃度過高或過低，影響菌體的生長和產(chǎn)物合成；代謝產(chǎn)物的積累可能對菌體產(chǎn)生反饋抑制作用，降低疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前，卡介苗的制備周期長，生產(chǎn)復(fù)雜，易染菌，質(zhì)量不穩(wěn)定；且，得到的疫苗有效期短，卡介菌活力衰減快；且用于制備疫苗的處方篩選限制條件多，影響產(chǎn)品的凍干效果。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本申請的目的在于提供一種卡介苗凍干制劑的制備方法及其應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)卡介苗活菌數(shù)少、制備周期長的問題。
2、為實現(xiàn)上述申請目的，本申請采用的技術(shù)方案如下：
3、第一方面，本申請?zhí)峁┮环N卡介苗凍干制劑的制備方法，包括如下步驟：
4、采用復(fù)合middlebrook?7h9培養(yǎng)基進行卡介菌培養(yǎng)；復(fù)合middlebrook?7h9培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)middlebrook?7h9培養(yǎng)基、白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶混合補劑、吐溫80；
5、收集培養(yǎng)后的菌體，加入凍干保護劑進行分散混勻處理，得到卡介菌混懸液；凍干保護劑包括海藻糖、甘露醇、氯化鉀和泰洛沙酚；
6、將卡介菌混懸液進行凍干處理，得到卡介苗。
7、在一些實施例中，以復(fù)合middlebrook?7h9培養(yǎng)基的總質(zhì)量為100％計，白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶混合補劑的添加量為10wt％～12wt％，吐溫80的添加量為1wt％～1.5wt％。
8、在一些實施例中，凍干保護劑中，包括如下份數(shù)的組分：
9、海藻糖??????0.5～10份；
10、甘露醇??????2～4份；
11、氯化鉀??????0.9～1.0分；
12、泰洛沙酚????0.01～0.02份。
13、在一些實施例中，采用復(fù)合middlebrook?7h9培養(yǎng)基進行卡介菌培養(yǎng)的步驟中，卡介菌的接種量為5％～7％，培養(yǎng)溫度為36～37℃，采用200～210轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速進行振蕩通氣培養(yǎng)，保持培養(yǎng)基的含氧量為10％～12％，控制ph為6.3～6.5，培養(yǎng)時間為5～6天。
14、在一些實施例中，采用復(fù)合middlebrook?7h9培養(yǎng)基進行卡介菌培養(yǎng)的步驟中，卡介菌的接種量為5％，培養(yǎng)溫度為37℃，采用200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速進行振蕩通氣培養(yǎng)，保持培養(yǎng)基的含氧量為10％，控制ph為6.3，培養(yǎng)時間為5天。
15、在一些實施例中，培養(yǎng)后的菌體需要采用鋼珠進行低溫研磨處理，低溫研磨處理的溫度為2～8℃，且，鋼珠與菌體的質(zhì)量比為1000:1～1.2。
16、在一些實施例中，卡介菌混懸液的濃度為1～1.2mg/ml。
17、在一些實施例中，凍干處理包括如下步驟：
18、將卡介菌混懸液于5℃下保溫30分鐘；
19、于1小時內(nèi)將溫度從5℃降到-40℃以下，保持4小時；
20、于1小時內(nèi)將溫度從-40℃升溫到-20℃，保持4小時，控制真空度為30pa；
21、于2小時內(nèi)將溫度從-20℃升溫到30℃，保持4小時，控制真空度為10pa。
22、第二方面，本申請?zhí)峁┮环N卡介苗凍干制劑，卡介苗凍干制劑采用上述的卡介苗凍干制劑的制備方法制備得到。
23、在一些實施例中，卡介苗凍干制劑中，活菌數(shù)均值≥7.0×106cfu/mg，熱穩(wěn)定性試驗后活菌數(shù)均值≥6.8×106cfu/mg。
24、本申請第一方面提供的卡介苗凍干制劑的制備方法，該制備方法中采用了復(fù)合middlebrook?7h9培養(yǎng)基進行卡介菌培養(yǎng)，該復(fù)合middlebrook?7h9培養(yǎng)基以middlebrook7h9培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加了白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶混合補劑、吐溫80作為營養(yǎng)添加劑，保證卡介菌快速生長的同時，確保其活性較高，有利于大大縮短卡介菌的培養(yǎng)時間，更有利于批量化生成；其次，采用凍干保護劑對菌體進行分散處理，其中，提供的凍干保護劑包括氯化鉀和泰洛沙酚，采用氯化鉀代替pbs溶液中的氯化鈉，使緩沖液的離子組成更接近細胞內(nèi)的離子環(huán)境，有助于更好地維持細胞的正常生理功能和形態(tài)，提高成品制劑中的活菌數(shù)，提供泰洛沙酚可有利于防止產(chǎn)品團聚，保證產(chǎn)品的均勻性；因此，提供的制備方法工藝簡單，生產(chǎn)周期短，活菌數(shù)量高、性質(zhì)穩(wěn)定，易于保存，在臨床上具有很好的應(yīng)用價值。
25、本申請第二方面提供的卡介苗凍干制劑，提供的卡介苗凍干制劑由上述卡介苗凍干制劑的制備方法制備得到，由于上述卡介苗凍干制劑的制備方法采用復(fù)合middlebrook7h9培養(yǎng)基和凍干保護劑進行聯(lián)合使用，得到的卡介苗凍干制劑初檢活菌數(shù)高、耐熱后活菌數(shù)穩(wěn)定、從而在貯存、運輸及高溫地區(qū)使用中保持制品質(zhì)量的持續(xù)穩(wěn)定性，緩解卡介苗供應(yīng)緊缺的問題。
1.一種卡介苗凍干制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡介苗凍干制劑的制備方法，其特征在于，以所述復(fù)合middlebrook?7h9培養(yǎng)基的總質(zhì)量為100％計，所述白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶混合補劑的添加量為10wt％～12wt％，所述吐溫80的添加量為1wt％～1.5wt％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡介苗凍干制劑的制備方法，其特征在于，所述凍干保護劑中，包括如下份數(shù)的組分：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡介苗凍干制劑的制備方法，其特征在于，采用復(fù)合middlebrook?7h9培養(yǎng)基進行卡介菌培養(yǎng)的步驟中，卡介菌的接種量為5％～7％，培養(yǎng)溫度為36～37℃，采用200～210轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速進行振蕩通氣培養(yǎng)，保持培養(yǎng)基的含氧量為10％～12％，控制ph為6.3～6.5，培養(yǎng)時間為5～6天。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的卡介苗凍干制劑的制備方法，其特征在于，采用復(fù)合middlebrook?7h9培養(yǎng)基進行卡介菌培養(yǎng)的步驟中，卡介菌的接種量為5％，培養(yǎng)溫度為37℃，采用200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速進行振蕩通氣培養(yǎng)，保持培養(yǎng)基的含氧量為10％，控制ph為6.3，培養(yǎng)時間為5天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡介苗凍干制劑的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)后的菌體需要采用鋼珠進行低溫研磨處理，所述低溫研磨處理的溫度為2～8℃，且，所述鋼珠與所述菌體的質(zhì)量比為1000:1～1.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡介苗凍干制劑的制備方法，其特征在于，所述卡介菌混懸液的濃度為1～1.2mg/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡介苗凍干制劑的制備方法，其特征在于，所述凍干處理包括如下步驟：
9.一種卡介苗凍干制劑，其特征在于，所述卡介苗凍干制劑采用權(quán)利要求1～8任一所述的卡介苗凍干制劑的制備方法制備得到。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的卡介苗凍干制劑，其特征在于，所述卡介苗凍干制劑中，活菌數(shù)均值≥7.0×106cfu/mg，熱穩(wěn)定性試驗后活菌數(shù)均值≥6.8×106cfu/mg。