背景技術(shù)：
1、松塔的化學(xué)成分復(fù)雜，通常包含多種活性成分，且其藥效往往依賴(lài)于多種成分的協(xié)同作用，這些成分可能在不同消化道區(qū)域被代謝。通過(guò)序貫代謝研究，可以了解這些成分在體內(nèi)的代謝路徑和相互作用，從而更好地理解中藥的藥效機(jī)制。序貫代謝理論為其研究提供了新的視角和方法，尤其是在理解體內(nèi)代謝過(guò)程、藥效機(jī)制以及安全性方面具有重要意義。
2、目前現(xiàn)代研究尚未涉及松塔體內(nèi)的代謝產(chǎn)物鑒定研究，及其進(jìn)入體內(nèi)后其他化學(xué)成分的變化，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：針對(duì)背景技術(shù)中提到的問(wèn)題，提供一種有效的松塔提取物基礎(chǔ)藥效物質(zhì)的分析檢測(cè)方法。
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
3、本發(fā)明是一種松塔提取物藥效成分分析方法，包括以下步驟:
4、1、松塔供試品制備和檢測(cè)
5、松塔粗粉10kg，用85％乙醇提取2次，每次用乙醇4l，浸泡24h。過(guò)濾，將殘?jiān)脽崴崛?，過(guò)濾除去熱水提取液。在室溫條件下，向殘?jiān)屑訅A液進(jìn)行提取并過(guò)濾得到堿性提取液。用醋酸調(diào)所得堿性提取液的ph值至5，濃縮、過(guò)濾，去除沉淀。濾液用1倍量乙醇沉淀24h,過(guò)濾，得沉淀；濾液再用2倍量乙醇沉淀24h，過(guò)濾，得沉淀；濾液再用5倍量乙醇沉淀24h,過(guò)濾，得沉淀，三次沉淀合并，為松塔提取物。
6、供試品制備：取適量松塔提取物，使用krebs-ringer液溶解，配制成濃度為20mg/ml的供試品溶液。
7、50mg醇提物渦旋1min,加入600μl-20℃預(yù)冷的70％甲醇水溶液，渦旋15min，離心(12000r/min，4℃)3min，取上清液用微孔濾膜(0.22μm)過(guò)濾，對(duì)供試品進(jìn)行uplc-ms/ms檢測(cè)。
8、2.序貫代謝研究
9、隨機(jī)選取4只大鼠，10％水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈采血，置于37℃保溫，用于補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)大鼠的損失血量。
10、2.1.1腸道菌群代謝組
11、另隨機(jī)選取1只大鼠麻醉，沿腹中線剪開(kāi)腹腔選取10cm結(jié)腸，前后各開(kāi)一個(gè)小口，將供試品灌注進(jìn)結(jié)腸后結(jié)扎，將藥液封閉在結(jié)腸，同時(shí)結(jié)扎肝門(mén)靜脈。頸動(dòng)脈插管，將采集的腹主動(dòng)脈血液通過(guò)注射泵供血。腸系膜靜脈插管，收集血液。將潤(rùn)濕的紗布蓋在大鼠腹部，保溫?zé)艏訜?，大鼠背部加熱墊加熱。血液采集后-80℃冰箱保存。uplc-ms/ms檢測(cè)。
12、2.1.2腸道無(wú)菌代謝組
13、與2.1.1操作相同，區(qū)別在藥液進(jìn)入結(jié)腸前，用37℃生理鹽水沖出結(jié)腸內(nèi)容物，繼續(xù)充入空氣將生理鹽水排盡。
14、2.1.3腸道酶抑制代謝組
15、與2.1.2操作相同，區(qū)別在生理鹽水和藥液中加入cyp450酶的抑制劑氨基苯并三唑。
16、2.1.4肝代謝組
17、與2.1.1操作相同，區(qū)別在不需要供血，不需要結(jié)扎肝門(mén)靜脈。
18、對(duì)步驟1、步驟2.1.1、步驟2.1.2、步驟2.1.3、步驟2.1.4的uplc-ms/ms檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析解析松塔活性成分的體內(nèi)代謝過(guò)程。
19、3.胃腸道穩(wěn)定性研究：消化液(人工胃液和人工腸液)預(yù)溫孵5min后，分別在50ml人工胃液和50ml人工小腸液中加入1ml供試品溶液，取0h樣品。在37℃下振蕩溫孵，人工胃液組的取樣時(shí)間點(diǎn)為1、2、3、4、5h。人工小腸液組的取樣時(shí)間點(diǎn)為1、2、3、4、5、6、7h，每次取樣5ml,取樣后立即用0.1mol/lnaoh調(diào)ph為6-7終止反應(yīng)，用純凈水定容至8ml，放置于-80℃冰箱保存。從-80℃冰箱中取出血漿樣品，冰上解凍，渦旋10s混勻。吸取50μl樣本，放入到1.5ml離心管中，加入300μl?20％乙腈甲醇含內(nèi)標(biāo)提取液渦旋3min，12000r/min，4℃，離心10min。移取200μl上清液，放入到另一個(gè)1.5ml離心管中，在-20℃冰箱中靜置30min。12000r/min，4℃，再次離心3min；移取180μl上清液，保存于進(jìn)樣瓶中，用于uplc-ms/ms檢測(cè)。比較不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果之間的相關(guān)性確定胃腸道穩(wěn)定性。相關(guān)性系數(shù)越接近1，說(shuō)明樣本間的相關(guān)性越強(qiáng)，供試品在胃腸道中越穩(wěn)定。
20、本發(fā)明的色譜條件和質(zhì)譜條件如下：
21、色譜條件
22、色譜柱：agilent?sb-c181.8μm，2.1mm*100mm；流動(dòng)相：a相為純凈水(加入0.1％的甲酸)，b相為乙腈(加入0.1％的甲酸)；洗脫梯度：0～9min，5％～95％b；9～10min，95％b；10-11min，95％-5％b；11-14min，5％b。流速0.35ml/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量2μl。
23、質(zhì)譜條件
24、電噴霧離子源(electrospray?ionization，esi)溫度500℃；離子噴霧電壓(is)5500v(正離子模式)/-4500v(負(fù)離子模式)；離子源氣體i(gsi)，氣體ii(gsii)和氣簾氣(cur)分別設(shè)置為50、60和25psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。qqq掃描使用mrm模式，并將碰撞氣體(氮?dú)?設(shè)置為中等。根據(jù)二級(jí)譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性，利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)定量分析，采用analyst?1.6.3軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
25、有益效果
26、1、本研究采用序貫代謝的方法，結(jié)合uplc-ms/ms，解析了其在大鼠體內(nèi)的原型成分和代謝產(chǎn)物，排除了大量無(wú)法吸收入血的成分，更容易鎖定其發(fā)揮藥效的成分。
27、2、與傳統(tǒng)的入血成分檢測(cè)相比，序貫代謝能夠系統(tǒng)地描在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，揭示其在不同代謝階段的轉(zhuǎn)化和作用機(jī)制。
28、3、通過(guò)差異倍數(shù)篩選，能夠簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)分析流程，排除差異性不顯著的物質(zhì)，縮小研究范圍，篩選出真正具有生物學(xué)意義的物質(zhì)，鎖定潛在藥用成分。
29、4、序貫代謝理論為松塔的研究提供了重要的理論框架和方法指導(dǎo)。通過(guò)序貫代謝研究，可以系統(tǒng)地解析松塔活性成分的體內(nèi)代謝過(guò)程、闡明其藥效機(jī)制、指導(dǎo)其臨床應(yīng)用、提高其安全性，并推動(dòng)松塔相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。
1.一種松塔提取物藥效成分分析方法，包括以下步驟:
2.如權(quán)利要求1所述的松塔提取物藥效成分分析方法，所述方法還包括胃腸道穩(wěn)定性測(cè)試，所述測(cè)試方法如下：
3.如權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的一種松塔提取物藥效成分分析方法，所述uplc-ms/ms檢測(cè)條件為：
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的一種松塔提取物藥效成分分析方法，所述松塔提取物供試品的制備方法如下：