本發(fā)明屬于化妝品，具體涉及一種抗衰融合囊泡及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、衰老是不可避免的自然生命過程，尋找延緩甚至逆轉(zhuǎn)皮膚衰老的方式已成為醫(yī)學(xué)美容和抗衰老領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。表皮和成纖維細(xì)胞的功能障礙以及細(xì)胞外基質(zhì)的組成和含量的變化是皮膚衰老的常見病理生理表現(xiàn)。

2、干細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡具有很強(qiáng)的促進(jìn)組織修復(fù)和再生的能力，在抗衰老治療中具有應(yīng)用潛力。作為無細(xì)胞療法的替代品，干細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡可避免干細(xì)胞移植中的免疫排斥、干性維持、細(xì)胞衰老和腫瘤發(fā)生等風(fēng)險，不僅能促進(jìn)敏感肌和衰老肌膚的修復(fù)，加快皮膚活力再生，還具有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等多種功能。但是由于細(xì)胞外囊泡對于功效成分(視黃酸、視黃醇、熊果苷等)有限的包載率，影響其在化妝品、醫(yī)美領(lǐng)域的應(yīng)用。

3、傳統(tǒng)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)成分與角質(zhì)層細(xì)胞膜的成分相似，提高了其生物相容性。但在透皮過程中容易發(fā)生聚集而無法深入皮膚深層，同時結(jié)構(gòu)中的磷脂易氧化而影響穩(wěn)定性。

4、因此，有待結(jié)合細(xì)胞外囊泡和脂質(zhì)體的有益功效，開發(fā)復(fù)合功效成分載體系統(tǒng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種抗衰融合囊泡及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明提供的融合囊泡能延緩皮膚光老化進(jìn)程，具有優(yōu)異的抗衰效果。

2、為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種抗衰融合囊泡，所述融合囊泡包括間充質(zhì)干細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡和脂質(zhì)體的融合產(chǎn)物；所述脂質(zhì)體包括磷脂、膽固醇和兩親性聚合物組裝形成的載體，以及負(fù)載于載體疏水層的脂溶性活性物和負(fù)載于載體親水內(nèi)腔的水溶性活性物；

4、所述脂溶性活性物包括視黃酸、白藜蘆醇或視黃醇中的任意一種或至少兩種的組合；所述水溶性活性物包括熊果苷、泛醇、煙酰胺、依克多因、玻色因、玻尿酸或維生素c中的任意一種或至少兩種的組合。

5、本發(fā)明提供的融合囊泡同時包載脂溶性和水溶性的活性護(hù)膚組分，可實(shí)現(xiàn)多成分的組合應(yīng)用，顯著提高活性護(hù)膚組分的遞送效率，降低游離組分對皮膚的直接刺激性；間充質(zhì)干細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡中攜帶豐富的蛋白分子、脂質(zhì)分子和microrna，聯(lián)合活性護(hù)膚組分可有效抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1(mmp-1)的表達(dá)量，延緩皮膚光老化進(jìn)程，具有優(yōu)異的抗衰效果。本發(fā)明中抗衰融合囊泡的平均粒徑為100-200nm。

6、優(yōu)選地，所述細(xì)胞外囊泡和脂質(zhì)體的數(shù)量比為(1-5):(1-10)。

7、(1-5)中的具體點(diǎn)值可以為1、1.2、1.5、1.7、2、2.3、2.5、2.8、3、3.5、4、4.5或5等。

8、(1-10)中的具體點(diǎn)值可以為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10等。

9、上述各項(xiàng)數(shù)值范圍內(nèi)的其他具體點(diǎn)值均可選擇，在此便不再一一贅述。

10、本發(fā)明中細(xì)胞外囊泡和脂質(zhì)體在上述配比范圍內(nèi)融合，發(fā)揮的抗衰效果更加顯著。

11、優(yōu)選地，所述載體中磷脂、膽固醇和兩親性聚合物的質(zhì)量比為(140-160):(20-30):(5-15)。

12、(140-160)中的具體點(diǎn)值可以為140、142、145、147、150、153、155、158或160等。

13、(20-30)中的具體點(diǎn)值可以為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30等。

14、(5-15)中的具體點(diǎn)值可以為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15等。

15、上述各項(xiàng)數(shù)值范圍內(nèi)的其他具體點(diǎn)值均可選擇，在此便不再一一贅述。

16、優(yōu)選地，所述載體和脂溶性活性物的質(zhì)量比為1:(0.01-0.1)。

17、(0.01-0.1)中的具體點(diǎn)值可以為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.1等。

18、上述各項(xiàng)數(shù)值范圍內(nèi)的其他具體點(diǎn)值均可選擇，在此便不再一一贅述。

19、優(yōu)選地，所述載體和水溶性活性物的質(zhì)量比為1:(0.1-5)。

20、(0.1-5)中的具體點(diǎn)值可以為0.1、0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5等。

21、上述各項(xiàng)數(shù)值范圍內(nèi)的其他具體點(diǎn)值均可選擇，在此便不再一一贅述。

22、優(yōu)選地，所述兩親性聚合物包括二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二棕櫚?；字Ｒ掖及?聚乙二醇或二月桂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇中的任意一種或至少兩種的組合。

23、優(yōu)選地，所述二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇、二棕櫚?；字Ｒ掖及?聚乙二醇或二月桂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇中聚乙二醇的數(shù)均分子量各自獨(dú)立地為1000-6000，例如可以為1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500或6000等。

24、上述各項(xiàng)數(shù)值范圍內(nèi)的其他具體點(diǎn)值均可選擇，在此便不再一一贅述。

25、優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞包括臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞或滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞中的任意一種或至少兩種的組合。

26、優(yōu)選地，所述脂溶性活性物為視黃酸，所述水溶性活性物為熊果苷和泛醇。

27、本發(fā)明優(yōu)選將視黃酸、熊果苷和泛醇包覆于融合囊泡內(nèi)，脂溶性和水溶性活性組分協(xié)同配伍，具有更好的基質(zhì)金屬蛋白酶-1(mmp-1)抑制效果，延緩皮膚光老化進(jìn)程，抗衰效果顯著。

28、優(yōu)選地，所述視黃酸、熊果苷和泛醇的質(zhì)量比為(0.02-0.06):(0.5-1):(1-3)。

29、(0.02-0.06)中的具體點(diǎn)值可以為0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055或0.06等。

30、(0.5-1)中的具體點(diǎn)值可以為0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1等。

31、(1-3)中的具體點(diǎn)值可以為1、1.2、1.5、1.7、2、2.3、2.5、2.8或3等。

32、上述各項(xiàng)數(shù)值范圍內(nèi)的其他具體點(diǎn)值均可選擇，在此便不再一一贅述。

33、本發(fā)明中視黃酸、熊果苷和泛醇在上述配比范圍內(nèi)，發(fā)揮的抗衰效果更加顯著。

34、優(yōu)選地，所述磷脂包括蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂或氫化大豆磷脂中的任意一種或至少兩種的組合。

35、第二方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的融合囊泡的制備方法，其特征在于，所述方法包括：

36、(1)培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，提取細(xì)胞外囊泡；

37、磷脂、膽固醇、兩親性聚合物、脂溶性活性物與有機(jī)溶劑混合溶解，蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，形成薄膜；加入水溶性活性物水溶液，超聲，制備脂質(zhì)體；

38、(2)將細(xì)胞外囊泡和脂質(zhì)體混合，超聲，孵育，循環(huán)凍融，通過聚碳酸酯膜擠出，得到所述融合囊泡。

39、優(yōu)選地，步驟(1)中，所述提取細(xì)胞外囊泡的方法包括超速離心法和/或膜過濾法。

40、優(yōu)選地，所述超速離心法包括將細(xì)胞培養(yǎng)液依次經(jīng)過第一次離心、第二次離心、第三次離心，收集上清液，再經(jīng)過第四次離心，收集沉淀，得到所述細(xì)胞外囊泡。

41、所述第一次離心的轉(zhuǎn)速為200-400g，例如可以為200g、220g、250g、270g、300g、330g、350g、380g或400g等；時間為5-15min，例如可以為5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min或15min等。

42、所述第二次離心的轉(zhuǎn)速為1000-3000g，例如可以為1000g、1200g、1500g、1700g、2000g、2300g、2500g、2800g或3000g等；時間為15-25min，例如可以為15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min或25min等。

43、所述第三次離心的轉(zhuǎn)速為9000-11000g，例如可以為9000g、9200g、9500g、9700g、10000g、10300g、10500g、10800g或11000g等；時間為20-40min，例如可以為20min、22min、25min、27min、30min、33min、35min、38min或40min等。

44、所述第四次離心的轉(zhuǎn)速為140000-160000g，例如可以為140000g、142000g、145000g、147000g、150000g、153000g、155000g、158000g或160000g等；時間為80-100min，例如可以為80min、82min、85min、87min、90min、93min、95min、98min或100min等。

45、上述各項(xiàng)數(shù)值范圍內(nèi)的其他具體點(diǎn)值均可選擇，在此便不再一一贅述。

46、優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑包括乙醇、乙腈、氯仿或甲醇中的任意一種或至少兩種的組合。

47、優(yōu)選地，所述水溶性活性物水溶液中水溶性活性物的濃度為100-1000mg/l，例如可以為100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l、600mg/l、700mg/l、800mg/l、900mg/l或1000mg/l等。

48、優(yōu)選地，步驟(1)中，所述超聲的功率為100-300w，例如可以為100w、120w、150w、170w、200w、230w、250w、280w或300w等；超聲的時間為工作2-5s，例如可以為2s、2.2s、2.5s、2.7s、3s、3.3s、3.5s、3.8s、4s、4.5s或5s等；間歇1-3s，例如可以為1s、1.2s、1.5s、1.7s、2s、2.3s、2.5s、2.8s或3s等。

49、優(yōu)選地，步驟(1)中，所述超聲的次數(shù)為15-25次，例如可以為15次、16次、17次、18次、19次、20次、21次、22次、23次、24次或25次等。

50、上述各項(xiàng)數(shù)值范圍內(nèi)的其他具體點(diǎn)值均可選擇，在此便不再一一贅述。

51、優(yōu)選地，步驟(2)中，所述超聲的時間為20-40s，例如可以為20s、22s、25s、27s、30s、33s、35s、38s或40s等；所述超聲的次數(shù)為2-5次，例如可以為2次、3次、4次或5次等。

52、優(yōu)選地，所述孵育的溫度為30-40℃，例如可以為30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等；孵育的時間為20-40min，例如可以為20min、22min、25min、27min、30min、33min、35min、38min或40min等。

53、上述各項(xiàng)數(shù)值范圍內(nèi)的其他具體點(diǎn)值均可選擇，在此便不再一一贅述。

54、優(yōu)選地，所述循環(huán)凍融的過程具體為先液氮冷凍，再解凍。

55、優(yōu)選地，所述冷凍的時間為4-7min，例如可以為4min、4.2min、4.5min、4.7min、5min、5.3min、5.5min、5.8min、6min、6.5min或7min等。

56、優(yōu)選地，所述解凍的溫度為25-35℃，例如可以為25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃等；解凍的時間為10-20min，例如可以為10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min等。

57、上述各項(xiàng)數(shù)值范圍內(nèi)的其他具體點(diǎn)值均可選擇，在此便不再一一贅述。

58、優(yōu)選地，所述循環(huán)凍融的次數(shù)為3-5次，例如可以為3次、4次或5次等。

59、優(yōu)選地，所述聚碳酸酯膜的尺寸為200-800nm，例如可以為200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm或800nm等。

60、優(yōu)選地，所述聚碳酸酯膜擠出的次數(shù)為20-50次，例如可以為20次、22次、25次、27次、30次、33次、35次、38次、40次、45次或50次等。

61、上述各項(xiàng)數(shù)值范圍內(nèi)的其他具體點(diǎn)值均可選擇，在此便不再一一贅述。

62、第三方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的融合囊泡在化妝品中的應(yīng)用，所述化妝品包括化妝水、乳液、面霜、精華、噴霧、面膜或防曬乳中的任意一種。

63、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備以下有益效果：

64、本發(fā)明提供的融合囊泡同時包載脂溶性和水溶性的活性護(hù)膚組分，可實(shí)現(xiàn)多成分的組合應(yīng)用，顯著提高活性護(hù)膚組分的遞送效率，降低游離組分對皮膚的直接刺激性；間充質(zhì)干細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡中攜帶豐富的蛋白分子、脂質(zhì)分子和microrna，聯(lián)合活性護(hù)膚組分可有效抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1(mmp-1)的表達(dá)量，延緩皮膚光老化進(jìn)程，具有優(yōu)異的抗衰效果。