本文是關(guān)于單克隆抗體，特別是小鼠的單克隆抗體，其對于人類癌細胞和組織的表面及胞漿中特異性抗原具有反應(yīng)活性的能力。

人類免疫系統(tǒng)包括由淋巴細胞產(chǎn)生血清蛋白，即抗體，淋巴細胞能夠與激發(fā)其生成的抗原決定族反應(yīng)。因為免疫系統(tǒng)對一種具有許多抗原決定族的通常反應(yīng)是產(chǎn)生各個決定族的抗體，所以天然產(chǎn)生的抗血清是異質(zhì)性的或多克隆的，或者說抗血清是由各對一種特異決定族產(chǎn)生抗體的多種不同的細胞產(chǎn)生的。當(dāng)在一個單一分子上出現(xiàn)一個以上的抗原決定族或特別是各引起一種抗體產(chǎn)生或免疫反應(yīng)時，即可將抗原決定族看作是抗原決定部位。某單一抗體分子只對一個抗原決定族或抗原決定部位是特異的。

單克隆抗體是針對抗原分子上單一抗原決定族或決定部位的單一抗體，而決定族或抗原決定部位可在分子的幾個部位重復(fù)。顯然，欲在體外制取這種單克隆抗體，便需要由通常多克隆免疫反應(yīng)誘生的大量抗體中篩選具有所要求之特征的單一抗體。體外制取單一的，高度特異性的單克隆抗體的基本技術(shù)是由Kohler，G.和MilsfeinC.建立的（Nature256∶495-497，1975），即所謂雜交細胞瘤技術(shù)。該方法包括用抗原免疫小鼠和從動物體內(nèi)收獲抗體，并將這些抗體生成細胞與一種不產(chǎn)生抗體的骨髓瘤細胞株即漿細胞腫瘤細胞相融合，以產(chǎn)生雜交瘤細胞。這些雜交瘤細胞在體外具有骨髓瘤細胞系所有的存活和生長的能力。并具有與之融合的B淋巴細胞的大量生產(chǎn)抗體的能力。此產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞可于體外進行培養(yǎng)或作為腫瘤在宿主動物體內(nèi)生長。因為每個抗體生成細胞產(chǎn)生唯一的一種抗體，所以雜交瘤的單克隆培養(yǎng)細胞可各產(chǎn)生一種單一的抗體，這種單一抗體可由體外培養(yǎng)雜交瘤細胞的培養(yǎng)基中獲得，或可由腹腔內(nèi)注射了這種細胞的小鼠腹水中獲得，亦可由帶雜交瘤之宿主動物的血清中得到。

雖然目前對產(chǎn)生雜交瘤和單克隆的一般方法已很清楚，但更應(yīng)加深研究的還是如何分離和保留培養(yǎng)的雜交瘤細胞。因為由不同的細胞所產(chǎn)生的抗體只與同一分子上的不同抗原決定族反應(yīng)，故可知針對一種主要抗原產(chǎn)生抗體的分離克隆在克隆與克隆之間是不同的。對所得到的抗體或含抗體的培養(yǎng)基、血清或腹水進行足夠的試驗是必要的。鑒于每個克隆對產(chǎn)生單克隆抗體造成的復(fù)雜性，而這些抗體又被應(yīng)用于珍斷和治療，故有必要對各克隆的抗體進行定性。

欲得到所需要的單克隆抗體，就必須對那些將誘生某種特異抗體的抗原決定族作出鑒定和定位。或者由已完全融合的細胞建立幾百個雜交瘤克隆，并針對正?；蚍钦＝M織以及在鑒別和限定那種產(chǎn)生具有需要的結(jié)合特異性的抗體的克隆中的不同抗原進行徹底篩選。根據(jù)其所產(chǎn)生的抗體，決定了細胞表面上與腺癌和鱗狀細胞癌-這兩種基本類型的癌之細胞表面標(biāo)志上的結(jié)構(gòu)差異。本文首要目的是產(chǎn)生并維持能與這一特殊的抗原決定族相結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤，以達到所需要的功能特異性。

已知單克隆抗體可被各種不同標(biāo)記物所標(biāo)記，以備檢測、珍斷性分析或治療應(yīng)用。在上述各種情況下，標(biāo)記的單克隆抗體與抗原決定族部位的結(jié)合將成為一種特殊治療劑的檢定或傳送到非正常細胞上抗原決定族的信號。本文的再一個目的是提供適當(dāng)標(biāo)記的特異性單克隆抗體，借以完成篩選和應(yīng)用。

本發(fā)明特別應(yīng)用于鑒別出現(xiàn)于腺瘤和鱗狀細胞癌這兩種特定疾病中的癌細胞。

對人類新生物組織之細胞表面和胞漿中特有抗原決定族特異的鼠之單克隆抗體已經(jīng)制得。這種特有的抗原決定族被定名為“KC-4抗原”，它誘生只與新生物細胞結(jié)合而不與正常人體組織細胞結(jié)合的抗體。這種特殊的抗原在比較小的癌瘤細胞膜上表現(xiàn)有兩種形式。第一種是較大形式的且只出現(xiàn)于胞漿中的，其分子量約為490，000道爾頓（范圍480，000～510，000）。第二種是以高密度形式表達的，出現(xiàn)于癌細胞的胞漿內(nèi)和胞膜上，用電泳方法測定并以其移動與已知分子量的商品蛋白質(zhì)分子進行比較，其分子量約為438，000道爾頓（范圍390，000～450，000之間）。（Towdin，etalproc.Natl.Acad.Sci.76∶4350-4354，1979andLaemmli，U.K.Nature，227∶680，1970），被稱為“KC-4”的單克隆抗體通過標(biāo)記，主要應(yīng)用于癌癥的診斷和治療。

KC-4單克隆抗體特別適用于與人類患有任何器官原發(fā)腺癌和鱗狀細胞癌時出現(xiàn)的癌細胞上或癌細胞內(nèi)的抗原決定族相結(jié)合。

作者提供了對腺癌和鱗狀上皮癌等人類癌組織之表面或胞漿內(nèi)特殊抗原特異的小鼠的單克隆抗體。這種特有的抗原，定名為“KC-4抗原”，是由包括前列腺癌的人類癌組織產(chǎn)生的。所有對限定的“KC-4抗原”具有這種特異性的單克隆抗體均可看作是“KC-4”。

Balb/c小鼠經(jīng)兩周時間予以腹腔內(nèi)接種前列腺腺癌細胞。以獲得同樣腫瘤組織的粗制腫瘤勻漿作為免疫原經(jīng)兩次強化和再注射后，切除動物脾臟，澆注四天以便分離單個細胞。用改良的Kohler和Milstein方法（Nature256∶495-497，1975），將小鼠漿細胞瘤細胞系Sp2/0-Ag14的細胞與小鼠脾細胞融合。之后在HAT培養(yǎng)其中將融合的細胞培養(yǎng)10-14天，使其在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并增殖細胞克隆。除去含有由各克隆分泌的抗體的條件培養(yǎng)基并由其作特異活性之篩選。將培養(yǎng)基加入正常的和前列腺腺癌組織，將表現(xiàn)出有所要求之反應(yīng)活性的融合細胞克隆產(chǎn)生單一克隆化，并進一步以其對包括癌細胞在內(nèi)的各種正常和惡性組織進行試驗。

篩選融合之細胞克隆-KC-4生成克隆的過程是在軟凝膠中完成的。將細胞與液化的瓊脂糖混合，以該混合物在平板上鋪板并使之固化。之后溫育平板并監(jiān)測之，在第10-14天收獲個別克隆。通過免疫過氧化物酶和免疫熒光染色的人類組織或細胞系分別篩選克隆。分離出產(chǎn)生所要之抗體的克隆并于瓊脂糖中再次克隆化以進一步保障其穩(wěn)定性和單克隆性質(zhì)。

“KC-4”單克隆抗體試驗證明在癌細胞上有很明顯的膜和胞漿抗原分布，而在正常人組織則沒有特異的或陽性的染色譜。

KC-4單克隆抗體對正常和人新生物組織的反應(yīng)活性是通過包括生物素/抗生物素蛋白免疫過氧化物酶和免疫熒光染色的這兩種方法測定的。將固定的和石蠟包埋的組織、冷凍切片、新鮮腫瘤細胞和細胞系用于證明被鑒定之特殊抗原的組織分布。將大部分腫瘤細胞具有明顯的膜和/或胞漿陽性染色視為用KC-4所作試驗的陽性結(jié)果。整個篩選分析過程未見有正常組織標(biāo)本或正常細胞的特異反應(yīng)活性。

用KC-4抗體試驗了104例實體瘤或肺、結(jié)腸、腎、乳腺、胃、前列腺、胰、淋巴結(jié)、以及淋巴瘤等腫瘤組織。所有這些都是經(jīng)過加熱處理并石蠟包埋的組織。其中94%（98/104）為陽性。所有陽性染色均只出現(xiàn)于瘤細胞上、而所有正常組織則不受影響。有6%呈假陰性，這是由于組織標(biāo)品制備不好，組織被破壞而不是因為KC-4真正的存在于細胞上。

用KC-4抗體試驗了92例石蠟包埋的不同正常組織，包括脊髓、乳腺、子宮、甲狀腺、舌、前列腺、脾、腎上腺、肺、腎、膽囊、心臟、淋巴結(jié)、胃、結(jié)腸、肝、腦、睪丸、胸腺及胎盤。所有92例均為加熱處理，石蠟制備的組織。證明只有15.2%（14/92）有一定程度的染色。所有這些陽性例中，其染色均見于這些組織的正常的人為現(xiàn)象。正常組織的大量非特異性染色的是在乳腺、腎和胃組織。乳腺的染色見于腺體的腺細胞，這是通常可見的，是對抗體非特異的作用結(jié)果。在腎臟的遠曲小管偶見有若干染色。這幾乎用所有抗體均能看到，乃是器官非特異性所致。大多數(shù)抗體均可見有粘膜染色，正常胃組織和KC-4所作試驗即屬于這種情況。這種染色被認為是非特異性和人為造成的。

將取自前列腺、肺、腎、肝、淋巴結(jié)、脾、結(jié)腸、胸腺、乳腺、膽囊和胃的33份不同的正常組織制成新鮮冷凍切片并用KC-4抗體進行試驗。在處理這些標(biāo)本中沒有使用加熱方法。結(jié)果證明只有3%（1/33）有少許的陽性染色。值得注意的是，冷凍組織切片要比加熱處理的、福爾馬林固定的以及石蠟包埋的組織更接近新鮮組織。因此，KC-4在正常冷凍組織上的陽性染色的百分率（3%）與正常固定的/包埋的組織上的陽性染色百分率（15%）之差異，是由于組織制備中人為造成的。

進一步分析是用KC-4抗體染色法對冷凍的結(jié)腸、前列腺、肺和乳腺癌的人類腫瘤組織進行試驗。結(jié)果100%的惡性癌腫組織與KC-4呈陽性反應(yīng)，即觀察到深度胞漿和細胞表面的特異染色。

分離并鑒定了KC-4抗原分子，證實其具有兩種分子形式。較大的其分子量約為490，000道爾頓（范圍在480，000～510，000），只出現(xiàn)于癌細胞的胞漿中。較小的分子量約為438，000道爾頓（范圍在390，000～450，000），出現(xiàn)于癌細胞的胞漿中和胞膜上。分離是通過人乳腺癌的HT-17細胞系之細胞溶解素完成的，以1×108細胞/ml的濃度在蒸餾水中反復(fù)凍融。以100，000×g離心分離出溶解產(chǎn)物，以制備膜碎片和胞漿上清液。將胞漿在SDS-PAGE樣品緩沖液中作1∶1稀釋。將膜溶解于SDS-PAGE樣品緩沖液中。兩種樣品均于90°加熱5分鐘，然后，將相當(dāng)于23×10細胞的各樣品根據(jù)改良的LaemmilU.K.方法（Nature227，680，1980），在不連續(xù)垂直平板凝膠上進行上SDS聚丙烯酰胺（3.5～10%梯度）電泳分析。內(nèi)部分子量標(biāo)志物是血纖維蛋白原（340，000）、粘連蛋白（440，000）、肌球蛋白（200，000）、β-半乳糖苷酶（116，000）、磷酸化酶B（92，500）、牛血清蛋白（66，000）、卵白蛋白（43，000）、碳酸酐酶（30，000）、胰蛋白酶抑制劑（20，100）和α-乳清蛋白（14，000）。電泳完成后，依據(jù)改良的Towbin方法（Pro.Natl.Acad.Sci，76，4350，1979）將丙烯酰胺平板中的蛋白電吸印到硝酸纖維素薄膜上。在含有牛血清白蛋白緩沖液中封閉硝酸纖維素。以硝酸纖維素處理單克隆抗體KC-4，以結(jié)合定位在硝酸纖維素上的特異抗原。洗去未結(jié)合的KC-4抗體后，以抗鼠免疫球蛋白-酶結(jié)合物與結(jié)合在硝石纖維素上的KC-4抗體反應(yīng)。洗去未結(jié)合的結(jié)合物，加入酶底物，在抗原泳動到的地方即可顯示出有顏色的帶。

與KC-4抗原產(chǎn)生特異反應(yīng)的KC-4單克隆抗體有兩種形式。根據(jù)其與羊抗鼠IgG和IgM抗體有反應(yīng)性而與其它的羊和/或兔抗鼠免疫球蛋白同型物特異抗體無反應(yīng)性，證明其為小鼠IgG和IgM同型物。

兩種能夠產(chǎn)生對KC-4抗原特異性的單克隆抗體雜交細胞系寄存于美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保藏中心（AmericanTypeCulrureCollection），并定名為HB8709（IgG）和HB8710（IgM）。

單一的，具有高度特異性的單克隆抗體在檢查和治療人類癌腫中成為診斷和治療的一種特別有價值的工具。

作為診斷工具，可將KC-4單克隆抗體與人類癌細胞的生物學(xué)樣品相接觸，可檢測出生物學(xué)樣品中由單克隆抗體和癌細胞之間形成的免疫復(fù)合物，所謂的復(fù)合細胞（omplexedcells）即單克隆抗體與人類腫瘤細胞。

該方法學(xué)亦可以用于檢測疑似癌癥和相關(guān)腫瘤之病人的血清或其它液體生物樣品中的KC-4抗原。

所謂復(fù)合物可通過以人類癌腫瘤的那種生物學(xué)樣品與能夠結(jié)合KC-4單克隆抗體的第二抗體接觸得以檢測。所說的第二抗體是用經(jīng)選擇的可檢測化合物（指示族，deteectorgroup）標(biāo)記的。

第二抗體與對KC-4抗原特異性的單克隆抗體結(jié)合時，即可使結(jié)合的復(fù)合物被檢測為帶標(biāo)記的。為了診斷上的應(yīng)用，所謂的指示基團可選自熒光化合物，酶（當(dāng)其與特異的底物反應(yīng)時可產(chǎn)生吸收或熒光指示基團）、放射性元素，或電子密集化合物。（Goldman，Morris，F(xiàn)luorescentAntibodyMethods，AcademiePress，NewYork，1968;Yoshitake，S.etal.Scand.J.Immunol.10∶1-6，1979;Hunter，W.M.&.Greenwood，F(xiàn).C.Preparationofiodine131labeledgrowthhormoneofhighspecificactivity，Nature194，495，1962）。

適于這種功能的探測物質(zhì)包括熒光化合物如熒光素、羅丹明、藻紅素、氨腈染料、以及任何其它能發(fā)射熒光的化合物。另一類探測物質(zhì)包括可形成熒光化合物的酶底物產(chǎn)物如N-甲基繖酮-B-D-半乳糖苷酶，或吸收化合物如DAB（二氨基聯(lián)苯胺）。這一類中尚有許多其它化合物。適于作探測物質(zhì)的放射性元素包括碘-125、碘-131、銦-11、鉍-210，以及其它幾種目前最常使用的化合物。電子密集指示族，目前已知的包括金和鐵氯化物。雖然這項研究主要用于體外癌癥診斷方面，但是也不排除將類似的標(biāo)記之KC-4抗體用于體內(nèi)診斷和治療。

KC-4單克隆抗體可用于檢測人類癌腫瘤。在這項應(yīng)用中，是處理KC-4單克隆抗體進行標(biāo)記使其能產(chǎn)生可檢測信號標(biāo)記的單克隆抗體以注入病人體內(nèi)，當(dāng)單克隆抗體與其抗原決定族結(jié)合時便可標(biāo)記腫瘤。這種可檢測的標(biāo)記包括放射性元素、熒光化合物或其它適宜的可檢測標(biāo)記物或化合物。這一研究方法同樣地適合于對冷凍的、固定的、或固定并加熱處理（石蠟包埋）的組織上的癌細胞進行體外診斷性檢測。另外的體外應(yīng)用包括對血清、血漿、或其它液體生物學(xué)樣品如腦脊液、尿和痰中的KC-4抗原，進行放射免疫分析、放射免疫定量測定、酶免疫分析或比濁測定。

在治療疑似腫瘤的病人方面，可用以抑制或消除人類腫瘤，是將與適當(dāng)之毒性劑連接的KC-4單克隆抗體，以控制的給藥程序注射到病人體內(nèi)，使所說的單克隆抗體或單克隆抗體-毒性劑結(jié)合物與腫瘤細胞結(jié)合，以殺傷之。這樣的毒性劑可以是化學(xué)治療劑、光激活的毒性劑或放射活性劑。放射活性劑的例子有碘-125，或鉍-210。化學(xué)治療劑可包括α-鏈或A鏈蓖麻蛋白，白喉毒素，或整個分子、細胞毒性亞德里亞霉素、甲基繭質(zhì)（mrthyltrexane）、以及鉑化合物如順氯氨鉑。光激活的毒性劑包括有紅外染料，如氰蘭染料類。