背景技術(shù)：

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、hla-e分子是特異性t細(xì)胞應(yīng)答的限制性元件。公開(kāi)了敲除細(xì)胞中hla-e基因以用于免疫療法方法(如car-t治療)的方法。經(jīng)修飾具有hla-e敲除的細(xì)胞改善所述細(xì)胞在同種異體過(guò)繼轉(zhuǎn)移療法中的性能。此類細(xì)胞具有改善的活性、保留和/或擴(kuò)增特性以用于過(guò)繼性癌癥免疫療法。具體地，hla-e敲除降低了修飾的細(xì)胞的免疫原性，以避免在同種異體(allogeneic)過(guò)繼轉(zhuǎn)移期間被宿主免疫系統(tǒng)排斥。因此，如本文所述的細(xì)胞中hla-e基因的雙等位基因敲除可被用于最小化細(xì)胞的免疫原性。所公開(kāi)的用于敲除細(xì)胞(例如同種異體免疫細(xì)胞)中的hla-e基因的方法，被用于增加所述細(xì)胞在宿主免疫細(xì)胞存在下的持久性和/或移植。

2、本發(fā)明還提供了一種使細(xì)胞中主要組織相容性復(fù)合體，i類，e(hla-e)基因的等位基因失活的方法，所述方法包括

3、向所述細(xì)胞引入組合物，所述組合物包含：

4、crispr核酸酶，或編碼該crispr核酸酶的多核苷酸分子；和

5、一種rna分子，其包含具有17-50個(gè)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，或編碼該rna分子的多核苷酸分子，

6、其中所述crispr核酸酶和所述rna分子的復(fù)合物影響所述hla-e基因的等位基因中的雙鏈斷裂。

7、在一些實(shí)施方案中，rna分子包含向?qū)蛄胁糠郑浒邢蛭挥趆la-e基因外顯子1-7中任一個(gè)內(nèi)的序列，或位于選自6:30489462-30489633、6:30489656-30490033、6:30490170-30490553、6:30491067-30491450、6:30491467-30491691、6:30492334-30492474和6:30492471-30492619中任一個(gè)的基因組范圍內(nèi)的序列。在一些實(shí)施方案中，rna分子的向?qū)蛄胁糠职?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸，所述17-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中任一項(xiàng)所示序列中的核苷酸。

8、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供了rna分子，其包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，所?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中任一項(xiàng)所示序列中的核苷酸。

9、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供了包含rna分子和crispr核酸酶的組合物，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，所?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?idno:1-7830中任一項(xiàng)所示序列中的核苷酸。

10、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供了使細(xì)胞中hla-e等位基因的失活的方法，所述方法包括向所述細(xì)胞遞送包含rna分子和crispr核酸酶的組合物，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠郑?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中任一項(xiàng)所示的序列中的核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是淋巴細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是t細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是t調(diào)節(jié)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是b細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是自然殺傷(nk)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是ipsc。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是成纖維細(xì)胞、血細(xì)胞、肝細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞或能夠重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)的任何其他細(xì)胞類型。在一些實(shí)施方案中，遞送至細(xì)胞在體內(nèi)、離體或體外進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，離體進(jìn)行所述方法，并且從個(gè)體患者提供/外植所述細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括將具有修飾/敲除hla-e等位基因的所得細(xì)胞一起引入個(gè)體患者的步驟。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞來(lái)源于待治療的個(gè)體患者。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞來(lái)源于供體。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞對(duì)于其被引入的個(gè)體患者是同種異體的。

11、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供了一種用于治療、減輕和/或預(yù)防宿主抗移植物排斥(host-versus-graft?rejection,hvg)的方法，所述方法包括向患有宿主抗移植物排斥(hvg)或處于患宿主抗移植物排斥(hvg)風(fēng)險(xiǎn)中的受試者的細(xì)胞遞送包含rna分子和crispr核酸酶的組合物，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，?7-50個(gè)述連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中任一項(xiàng)所示序列中的核苷酸。

12、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供了用于改善過(guò)繼細(xì)胞療法的細(xì)胞的活性和/或保留和/或擴(kuò)增的方法，所述方法包括向需要過(guò)繼細(xì)胞療法的受試者的細(xì)胞遞送包含rna分子和crispr核酸酶的組合物，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，所?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中任一項(xiàng)所示序列中的核苷酸。

13、在實(shí)施方案中，該方法用于增加細(xì)胞在宿主受試者的細(xì)胞中的持久性和/或移植，該方法包括向所述細(xì)胞遞送包含rna分子和crispr核酸酶的組合物，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，所?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中任一項(xiàng)所示序列中的核苷酸；以及將所述細(xì)胞引入所述宿主受試者。在一些實(shí)施方案中，在將細(xì)胞引入宿主受試者之前，細(xì)胞被進(jìn)一步分化。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞被進(jìn)一步工程化以表達(dá)嵌合抗原受體。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是干細(xì)胞、ipsc或祖細(xì)胞，并且在將細(xì)胞引入宿主受試者之前分化為t細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是t細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞被進(jìn)一步工程化以使另外的基因失活和/或被敲除，以便改進(jìn)所述細(xì)胞用于過(guò)繼轉(zhuǎn)移的用途，例如敲除另外的基因以避免在將所述細(xì)胞引入宿主受試者后的移植物抗宿主病(gvhd)。

14、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供了包含rna分子和crispr核酸酶的組合物用于使細(xì)胞中的hla-e等位基因失活的用途，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，所?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中任一項(xiàng)所示的序列中的核苷酸，所述用途包括向細(xì)胞遞送包含rna分子和crispr核酸酶的組合物，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，所?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中任一項(xiàng)所示的序列中的核苷酸。

15、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供了包含rna分子和crispr核酸酶用于使細(xì)胞中的faslg等位基因失活的藥物，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，所述連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中任一項(xiàng)所示的序列中的核苷酸，其中所述藥物通過(guò)向細(xì)胞遞送包含rna分子和crispr核酸酶的組合物來(lái)施用，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，所?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中任一項(xiàng)所示序列中的核苷酸。

16、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供了包含rna分子和crispr核酸酶的組合物用于改善用于治療、改善或預(yù)防宿主抗移植物排斥(hvg)或增加細(xì)胞在移植后的持久性的用途，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，所?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seqid?no:1-7830中任一項(xiàng)所述序列中核苷酸，所述用途包括向患有或處于經(jīng)歷宿主抗移植物排斥風(fēng)險(xiǎn)中的受試者的細(xì)胞遞送包含rna分子和crispr核酸酶的組合物，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠郑?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中任一項(xiàng)所示序列核中的核苷酸。

17、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供了包含含有rna分子和crispr核酸酶的組合物的藥物，所述藥物用于治療、改善或預(yù)防宿主抗移植物排斥(hvg)，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，所?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中任一項(xiàng)所示的序列中的核苷酸，其中所述藥物通過(guò)向患有或處于經(jīng)歷宿主抗移植物排斥(hvg)風(fēng)險(xiǎn)中的受試者的細(xì)胞遞送包含rna分子和crispr核酸酶的組合物來(lái)施用，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠郑?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中任一項(xiàng)所示序列中的核苷酸。

18、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供了包含rna分子和crispr核酸酶的組合物用于改善用于過(guò)繼性細(xì)胞療法的細(xì)胞的活性和/或保留和/或擴(kuò)增或增加所述細(xì)胞在移植后的持久性的用途，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，所?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中任一項(xiàng)所述序列中核苷酸，所述用途包括向需要過(guò)繼性細(xì)胞療法的受試者的細(xì)胞遞送包含rna分子和crispr核酸酶的組合物，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，所?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中任一項(xiàng)所示序列核中的核苷酸。

19、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供了一種用于使細(xì)胞中的hla-e等位基因失活的試劑盒，其包含rna分子、crispr核酸酶和/或tracrrna分子，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，所?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中的任一項(xiàng)所示序列中的核苷酸；和用于將所述rna分子、crispr核酸酶和/或tracrrna遞送至細(xì)胞的說(shuō)明書(shū)。

20、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供了治療疾病或病癥的方法，所述方法包括將本文所述的組合物或修飾的細(xì)胞中的任一項(xiàng)遞送至受試者，優(yōu)選地其中所述疾病或病癥是癌癥。

21、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供了一種用于治療或預(yù)防受試者中宿主抗移植物排斥(hvg)的試劑盒，其包含rna分子、crispr核酸酶、和任選地tracrrna分子，所述rna分子包含具有17-50個(gè)連續(xù)核苷酸的向?qū)蛄胁糠?，所?7-50個(gè)連續(xù)核苷酸含有seq?id?no:1-7830中的任一項(xiàng)所示序列中的核苷酸；以及用于將所述rna分子、crispr核酸酶、和任選地tracrrna遞送至患有或處于宿主抗移植物排斥(hvg)風(fēng)險(xiǎn)中的受試者的細(xì)胞的說(shuō)明書(shū)。