本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料，具體涉及一種光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠的制備方法。

背景技術(shù)：

1、水凝膠作為一種親水性的交聯(lián)聚合物網(wǎng)絡(luò)，因其能夠吸收并保留大量水分而備受關(guān)注。這種獨(dú)特的性質(zhì)使得水凝膠在模擬人體軟組織方面展現(xiàn)出巨大的潛力，特別是在組織工程中的支架材料、醫(yī)療植入物以及傷口敷料等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。水凝膠的制備通常涉及理化交聯(lián)過程，從而形成穩(wěn)定的聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)既包含了交聯(lián)的固體成分，也包含了液體成分，使其類似于生物體內(nèi)的軟組織。

2、絲膠蛋白(ss)作為一種天然大分子蛋白，主要包裹在絲素纖維的表層。在蠶繭中，絲膠蛋白的含量雖然不到30％，但其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成賦予了它多種生物活性。絲膠蛋白的分子量主要分布在20-400kda之間，是一種水溶性球狀蛋白，含有18種氨基酸，其中絲氨酸(ser)、天冬氨酸(asp)和甘氨酸(gly)的含量較高。然而，在實(shí)際生產(chǎn)中，絲膠蛋白往往作為紡織工業(yè)的副產(chǎn)品而被忽視和丟棄，這不僅造成了環(huán)境污染，還導(dǎo)致了資源的極大浪費(fèi)。

3、近年來，隨著對絲膠蛋白的深入研究，研究者們逐漸認(rèn)識到其潛在的應(yīng)用價(jià)值。絲膠蛋白具有親水保濕性、抗菌性、抗氧化性、抗紫外線以及抑制酪氨酸酶活性等多種生物活性，此外還能支持細(xì)胞黏附和增殖，以及刺激細(xì)胞分化。這些特性使得絲膠蛋白成為制備水凝膠的理想材料之一。目前已有報(bào)道將絲膠蛋白制備成水凝膠，并應(yīng)用于藥物載體或組織工程領(lǐng)域。絲膠蛋白水凝膠的制備方法多種多樣，包括物理處理法(高溫高壓自組裝、超聲法等)、化學(xué)交聯(lián)(戊二醛交聯(lián)、京尼平交聯(lián)等)、酶交聯(lián)(hrp/h2o2酶促原位交聯(lián)等)以及光交聯(lián)等。然而，這些方法在實(shí)際應(yīng)用中均存在一定的局限性。例如，使用絲素缺陷型突變蠶繭作為絲膠原材料的研究，其原材料來源有限，且不能有效解決絲膠蛋白作為工業(yè)副產(chǎn)物被丟棄所造成的環(huán)境問題；通過低溫溴化鋰的方式提取的絲膠蛋白只能以溶液的狀態(tài)低溫短期保存，溶液狀態(tài)下使用不確定性因素較多；采用高溫堿水法提取絲膠蛋白雖然可行，但在高溫堿性條件下，絲膠蛋白大分子鏈容易被降解成分子量較小的多肽鏈，導(dǎo)致純絲膠蛋白難以直接成膠，通常需要加入其他高分子聚合物來制備多單體復(fù)合水凝膠。

4、光交聯(lián)水凝膠是一種通過光觸發(fā)方式使水溶性小分子、預(yù)聚物或高分子骨架發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而形成的水凝膠。這種交聯(lián)方式具有非物理接觸光觸發(fā)交聯(lián)、交聯(lián)過程可控程度高、交聯(lián)效率高以及交聯(lián)條件簡單等優(yōu)點(diǎn)。在生物材料領(lǐng)域，光交聯(lián)制備水凝膠的反應(yīng)原理主要包括光引發(fā)自由基交聯(lián)反應(yīng)、光點(diǎn)擊交聯(lián)反應(yīng)或光偶聯(lián)交聯(lián)反應(yīng)，其中光引發(fā)自由基交聯(lián)反應(yīng)是應(yīng)用最早也是最普遍的方法。絲膠蛋白作為一種生物大分子，擁有豐富的極性基團(tuán)，如羥基、羧基和氨基等，這些基團(tuán)可以接枝不同的功能性基團(tuán)以制備光交聯(lián)絲膠水凝膠。在制備過程中，需要在絲膠蛋白上接枝光交聯(lián)基團(tuán)，如甲基丙烯酰胺(ma)和甲基丙烯酸縮水甘油酯(gma)，它們主要接枝在絲膠的氨基、羥基與羧基上，形成甲基丙烯?；z膠蛋白(serma)。

5、然而，傳統(tǒng)制備光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠的方法存在一些問題。已報(bào)道的高溫堿水法提取絲膠蛋白制備光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠需要經(jīng)過兩次透析步驟(一次去鹽透析，一次去改性單體透析)以及多次凍干過程，這導(dǎo)致制備流程冗長，效率低下，且容易造成絲膠溶液變質(zhì)，實(shí)驗(yàn)資源利用率低。具體而言，傳統(tǒng)的制備流程通常包括：首先通過熱堿水法提取絲膠蛋白，然后進(jìn)行第一次透析以去除鹽離子，接著凍干得到絲膠蛋白粉末。隨后，將絲膠蛋白粉末溶解在特定的溶劑中，滴加甲基丙烯酸酐或其他改性劑進(jìn)行改性，改性完成后再進(jìn)行第二次透析以去除多余的改性單體，最后再次凍干得到甲基丙烯?；z膠蛋白粉末。這一過程不僅耗時(shí)較長，而且多次的透析和凍干步驟增加了制備成本和操作復(fù)雜性。此外，不同的改性劑對環(huán)境的ph值有不同的要求。例如，ma改性通常在堿性環(huán)境下進(jìn)行，而gma改性則在中性或弱酸性環(huán)境下進(jìn)行。這進(jìn)一步增加了制備過程中的變量和復(fù)雜性。

6、因此，開發(fā)一種高效、簡便且適用于大規(guī)模生產(chǎn)的光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠制備方法顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠的制備方法，僅采用一步透析和一步凍干，使得制備甲基丙烯酰化絲膠蛋白的效率大大提高，并且通過調(diào)節(jié)絲膠蛋白與甲基丙烯酸酐的配比，進(jìn)一步提高了光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠的成型性。

2、本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

3、本發(fā)明提供一種光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

4、(1)采用碳酸鈉(na2co3)水溶液對生絲進(jìn)行脫膠處理，取出脫膠絲后得到脫膠溶液；

5、(2)向步驟(1)得到的脫膠溶液中加入甲基丙烯酰胺(ma)，在55-65℃下進(jìn)行改性，對改性后的絲膠蛋白進(jìn)行透析、過濾、離心、凍干處理，得到甲基丙烯酰化絲膠蛋白(serma)凍干粉末；

6、(3)將步驟(2)得到的甲基丙烯?；z膠蛋白凍干粉末、光引發(fā)劑和溶劑混合，得到光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠的前驅(qū)體溶液，對所述光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠的前驅(qū)體溶液進(jìn)行紫外光照射，固化后得到所述光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠。

7、本發(fā)明通過改進(jìn)工藝流程，采用ma直接改性堿性含鹽(na2co3)絲膠蛋白溶液，縮短了制備流程，提高了制備工藝的效率。具體地，減少了去鹽透析和凍干絲膠粉末的流程，直接采用高溫堿水法提取絲膠蛋白，利用得到的含鹽絲膠蛋白溶液的堿性環(huán)境，作為甲基丙烯酸酐的改性環(huán)境(無需將絲膠蛋白粉末溶解在堿性的pbs溶液中)，直接改性絲膠蛋白，通過簡單的過濾離心之后，僅通過一步透析除去多余的甲基丙烯酸酐單體，再通過凍干得到serma粉末可長期保存。然后將serma粉末、光引發(fā)劑和溶劑經(jīng)充分混合和紫外激發(fā)交聯(lián)制成具有良好的生物學(xué)性能的光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠。

8、進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述碳酸鈉水溶液中碳酸鈉的濃度為0.1-0.5g/l。

9、進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述脫膠處理的時(shí)間為2-3h。

10、具體地，步驟(1)中，采用碳酸鈉水溶液在煮沸狀態(tài)下對生絲進(jìn)行脫膠處理，取出脫膠絲后經(jīng)過濾得到脫膠溶液。

11、進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述脫膠溶液中絲膠蛋白的濃度為0.01-0.02g/ml。

12、甲基丙烯?；z膠蛋白(serma)的制備原理是利用甲基丙烯酸酐(ma)對脫膠溶液進(jìn)行化學(xué)修飾，使ma取代脫膠溶液中絲膠蛋白(ss)分子鏈上的伯胺基團(tuán)合成serma，從而在ss分子上引入雙鍵，使其具有光敏性，可在光引發(fā)劑存在時(shí)進(jìn)行聚合，用于光交聯(lián)形成光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠。

13、進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述脫膠溶液中絲膠蛋白與甲基丙烯酰胺的用量比為1g:(0.1-2)ml，優(yōu)選為1g:(0.5-2)ml。

14、通過調(diào)節(jié)絲膠蛋白與甲基丙烯酸酐的配比來優(yōu)化甲基丙烯化絲膠蛋白的甲基丙烯基團(tuán)的接枝率，進(jìn)一步提高光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠的成型性。

15、進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述改性的時(shí)間為6-7h。

16、進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述甲基丙烯?；z膠蛋白凍干粉末與溶劑的用量比為(0.1-0.2)g:1ml。

17、進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述光引發(fā)劑與溶劑的用量比為(0.002-0.01)g:1ml。

18、進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述光引發(fā)劑為苯基(2,4,6-三甲基苯甲?；?磷酸鋰鹽(lap)。

19、進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述溶劑為水。

20、進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述紫外光照射的條件為：紫外光的波長為395-405nm，光照強(qiáng)度為20-30mw/cm2。

21、進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述紫外光照射的時(shí)間為30s-10min，優(yōu)選為3-10min。

22、本發(fā)明的有益效果：

23、本發(fā)明構(gòu)建了一種制備時(shí)間更短、制備流程更為簡單、制備效率更高的光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠的方法，將常規(guī)制備流程的兩步透析和兩步凍干精簡至一步透析和一步凍干，使原本的長達(dá)兩個(gè)星期的serma制備流程縮短一倍。本發(fā)明提供的制備方法中所用原材料可為天然生絲的脫膠廢水，原材料來源廣泛，減少資源浪費(fèi)，制備得到的光交聯(lián)絲膠水凝膠具有良好的生物相容性和穩(wěn)定的理化性質(zhì)，在組織工程領(lǐng)域和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。