本公開一般涉及單細(xì)胞條形碼化的方法和應(yīng)用以及使用包含脂質(zhì)修飾的寡核苷酸的組合物進(jìn)行核苷酸測序的方法。
背景技術(shù):
1、單細(xì)胞rna測序已成為描繪細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄變化的有力工具。這種技術(shù)的主要優(yōu)點是能夠測查樣品中細(xì)胞的多樣性。所有單細(xì)胞rna測序方案都共有共同的初始步驟,其中將來自細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄rna轉(zhuǎn)化為cdna。下一步是通過諸如pcr和體外轉(zhuǎn)錄(ivt)的方法進(jìn)行擴(kuò)增。后續(xù)步驟(最終為測序)允許對基因產(chǎn)物的表達(dá)水平進(jìn)行定量。從單細(xì)胞中分離rna并進(jìn)行條形碼化是單細(xì)胞rna-seq中的第一個并且是關(guān)鍵的限制步驟。
2、最近,結(jié)合單細(xì)胞rna測序進(jìn)行了大規(guī)模篩選(使用shrna或crispr的遺傳擾動)以理解復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象。這些具有容易通過shrna或crispr?grna序列對樣品進(jìn)行識別/條形碼化的獨特優(yōu)點。遺傳擾動技術(shù)可直接與條形碼引入相結(jié)合(即,通過將polya+條形碼添加到grna或shrna本身中),而不涉及遺傳操縱的化學(xué)/藥物/患者篩選不能以可經(jīng)由scrna-seq“讀出”的方式進(jìn)行條形碼化。參見例如adamson等人,cell?167(7):1867-82(2016);aarts等人,genes?dev.31(20):2085-98(2017);jaitin等人,cell?167(7):1883-96(2016)。
3、在單細(xì)胞rna測序測定中,根據(jù)應(yīng)用,傳統(tǒng)上通過將分子條形碼添加到cdna片段或珠粒中來實現(xiàn)多重分析。這是在使用液滴微流體或使用微孔分離細(xì)胞后完成的。為了允許標(biāo)記來自在單個液滴(或微孔)中分離的細(xì)胞的cdna,珠粒可以與也含有條形碼的實時pcr(rt)引物(或在一些情況下與珠粒上的條形碼)一起使用。因此rt和條形碼化可以發(fā)生在每個單獨的液滴或孔中。目前的方法具有至少以下缺點:成本高、效率低、多重分析能力低。由于用于細(xì)胞乳液和與mrna捕獲珠粒共包封的離散通道的數(shù)目原因,基于商業(yè)液滴微流體的單細(xì)胞rna測序的當(dāng)前樣品多重分析能力僅限于八個。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本公開涉及包含特別設(shè)計成標(biāo)記細(xì)胞的寡核苷酸的組合物和用對應(yīng)于不同樣品制備(例如,患者、擾動、單次實驗的重復(fù)等)的不同外源寡核苷酸條形碼標(biāo)記的匯集細(xì)胞的組合物。通過以脂質(zhì)修飾的外源寡核苷酸的形式結(jié)合樣品特異性信息,樣品通過量水平將不再限于由微流體裝置的物理尺寸限定。增強(qiáng)樣品多重分析將降低單細(xì)胞rna測序的成本,限制由批次效應(yīng)引起的技術(shù)噪聲,并使單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集信息量更大。
2、本公開涉及組合物和使用這些組合物對單細(xì)胞進(jìn)行條形碼化以及使用脂質(zhì)修飾的寡核苷酸對取自受試者樣品的組織片段進(jìn)行rna測序分析的方法。在一些實施方案中,本公開提供包含脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸的組合物,所述脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸包含脂質(zhì)部分、條形碼區(qū)和捕獲序列。在一些實施方案中,本發(fā)明提供一種組合物,其包含:(a)包含脂質(zhì)部分和第一引物區(qū)的第一脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸;和(b)包含第二引物區(qū)、條形碼區(qū)和捕獲序列的第二dna寡核苷酸,其中所述第二引物區(qū)是所述第一引物區(qū)的反向互補(bǔ)體。在一些實施方案中,本公開提供一種組合物,其包含:(a)包含第一脂質(zhì)部分、第一雜交區(qū)和第一引物區(qū)的第一脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸;(b)包含第二雜交區(qū)和第二脂質(zhì)部分的第二脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸,其中所述第二雜交區(qū)是所述第一雜交區(qū)的反向互補(bǔ)體;和(c)包含第二引物區(qū)、條形碼區(qū)和捕獲序列的第三dna寡核苷酸,其中所述第二引物區(qū)是所述第一引物區(qū)的反向互補(bǔ)體。
3、在一些實施方案中,本公開提供標(biāo)記細(xì)胞樣品的方法、從細(xì)胞樣品中分離內(nèi)源性dna的方法或?qū)碜约?xì)胞樣品的核酸序列進(jìn)行測序的方法,所述方法包括:(a)使所述細(xì)胞樣品暴露于本文公開的一種或多種錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸或任何公開的組合物,持續(xù)足以使所述錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸將其自身包埋在所述細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)的時間段;(b)使所述細(xì)胞樣品暴露于與所述錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸互補(bǔ)的一種或多種標(biāo)記寡核苷酸,持續(xù)足以使所述錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸與所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸形成核酸的互補(bǔ)鏈的時間段;(c)將所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸與所述一種或多種錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸連接;并任選(d)通過檢測對應(yīng)于所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸的多個獨特核苷酸序列中的一個來檢測所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸的存在;和/或(e)基于一種或多種標(biāo)記寡核苷酸的存在分離所述細(xì)胞,其中通過檢測對應(yīng)于所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸的一個或多個獨特核苷酸序列來確定所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸的存在。在一些實施方案中,所公開的方法中使用的細(xì)胞樣品是來自受試者的組織樣品的細(xì)胞的三維制劑,厚度為約0.1微米至約99微米。在一些實施方案中,細(xì)胞膜是將細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞外部的點分開的質(zhì)膜,或其中細(xì)胞膜是核膜。
4、在一些實施方案中,本公開提供對來自受試者樣品的一個或多個細(xì)胞的核酸進(jìn)行測序的方法,包括:(a)將對應(yīng)于所述樣品的區(qū)域的厚度為約0.1微米至約99微米的三維制劑或切片中的所述一個或多個細(xì)胞分配到容器中;(b)用本文公開的寡核苷酸標(biāo)記對應(yīng)于所述樣品的區(qū)域的所述一個或多個細(xì)胞;(c)從所述一個或多個細(xì)胞中分離所述核酸;以及(d)對來自所述一個或多個細(xì)胞的所述核酸進(jìn)行測序。在一些實施方案中,所公開的方法還包括:(e)編譯來自所述一個或多個細(xì)胞中的每一個的序列信息。在一些實施方案中,所公開的方法還包括將所述核酸的所述序列信息和/或表達(dá)譜與所述樣品內(nèi)或所述受試者內(nèi)的所述一個或多個細(xì)胞的空間位置相關(guān)聯(lián)。
5、在一些實施方案中,所公開的方法中的編譯步驟包括產(chǎn)生對應(yīng)于所述樣品的區(qū)域的所述一個或多個細(xì)胞中的每一個的表達(dá)譜。在一些實施方案中,所公開的方法中的標(biāo)記步驟包括:(w)使所述一個或多個細(xì)胞暴露于一種或多種錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸,持續(xù)足以使所述錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸將其自身包埋在所述細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)的時間段;和/或(x)使所述一個或多個細(xì)胞暴露于與所述錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸互補(bǔ)的一種或多種標(biāo)記寡核苷酸,持續(xù)足以使所述錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸與所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸形成核酸的互補(bǔ)鏈的時間段;和/或(y)將所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸與所述一種或多種錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸連接;并任選(z)通過檢測對應(yīng)于所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸的一個或多個獨特核苷酸序列來檢測所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸的存在。在一些實施方案中,所公開的方法中的分離細(xì)胞的步驟包括基于一種或多種標(biāo)記寡核苷酸的存在分離所述細(xì)胞,其中通過檢測對應(yīng)于所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸的多個獨特核苷酸序列中的一個來確定所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸的存在。在一些實施方案中,在所公開的方法中使用的一種或多種錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸包括:(a)包含第一脂質(zhì)部分、第一雜交區(qū)和第一引物區(qū)的第一脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸;(b)包含第二雜交區(qū)和第二脂質(zhì)部分的第二脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸,其中所述第二雜交區(qū)是所述第一雜交區(qū)的反向互補(bǔ)體;和(c)包含第二引物區(qū)、條形碼區(qū)和捕獲序列的第三dna寡核苷酸,其中所述第二引物區(qū)是所述第一引物區(qū)的反向互補(bǔ)體。
6、在一些實施方案中,本公開提供確認(rèn)受試者的樣品或組織內(nèi)的核酸表達(dá)模式的空間位置的方法,所述方法包括:(a)將來自所述樣品或?qū)?yīng)于所述樣品的區(qū)域的組織的一個或多個細(xì)胞分配到多個容器中的一個中;(b)用本文公開的已知寡核苷酸使對應(yīng)于所述樣品的區(qū)域的所述一個或多個細(xì)胞暴露,持續(xù)足以使所述已知寡核苷酸摻入所述一個或多個細(xì)胞中的時間,每種寡核苷酸對于一個或多個細(xì)胞暴露于其中的所述多個容器中的一個是獨特的并且對應(yīng)于所述多個容器中的一個;(c)根據(jù)所述已知寡核苷酸從所述一個或多個細(xì)胞中分離核酸;(d)對來自所述一個或多個細(xì)胞的核酸的表達(dá)進(jìn)行定量和/或?qū)λ龊怂徇M(jìn)行測序;(e)將表達(dá)譜中的核酸表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化;以及(f)將來自所述一個或多個細(xì)胞的表達(dá)譜與所述細(xì)胞在所述樣品內(nèi)、相對于所述組織或在所述組織內(nèi)的空間位置相關(guān)聯(lián),其中在所述多個容器中的每一者中的本文公開的已知寡核苷酸獨立地選自以下中的一種或組合:(x)包含第一脂質(zhì)部分、第一雜交區(qū)和第一引物區(qū)的第一脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸;和/或(y)包含第二雜交區(qū)和第二脂質(zhì)部分的第二脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸,其中所述第二雜交區(qū)是所述第一雜交區(qū)的反向互補(bǔ)體;和/或(z)包含第二引物區(qū)、條形碼區(qū)和捕獲序列的第三dna寡核苷酸,其中所述第二引物區(qū)是所述第一引物區(qū)的反向互補(bǔ)體;其中分配步驟包括將厚度為約0.1至約99微米的所述樣品的切片或三維制劑放置到多個容器中的一個中。在一些實施方案中,所公開的方法還包括:(g)使所述細(xì)胞暴露于流式細(xì)胞術(shù)。在一些實施方案中,在所公開的方法中分離細(xì)胞的步驟包括使所述細(xì)胞暴露于流式細(xì)胞術(shù)。
7、在一些實施方案中,本公開提供對來自受試者樣品的一個或多個細(xì)胞的核酸進(jìn)行測序的方法,包括:(a)將對應(yīng)于所述樣品的區(qū)域的所述一個或多個細(xì)胞分配到容器中;(b)用本文公開的寡核苷酸標(biāo)記對應(yīng)于所述樣品的區(qū)域的所述一個或多個細(xì)胞;(c)從所述一個或多個細(xì)胞中分離所述核酸;以及(d)對來自所述一個或多個細(xì)胞的所述核酸進(jìn)行測序,其中分配步驟包括將厚度為約0.1至約99微米的所述樣品的切片或三維制劑放置到多個容器中的一個中。在一些實施方案中,所公開的方法還包括(e)編譯來自所述一個或多個細(xì)胞中的每一個的序列信息。在一些實施方案中,所公開的方法還包括將所述核酸的所述序列信息和/或表達(dá)譜與所述樣品內(nèi)或所述受試者內(nèi)的所述一個或多個細(xì)胞的空間位置相關(guān)聯(lián)。
8、在一些實施方案中,所公開的方法的編譯步驟包括產(chǎn)生對應(yīng)于所述樣品的區(qū)域的所述一個或多個細(xì)胞中的每一個的表達(dá)譜。在一些實施方案中,所公開的方法的標(biāo)記步驟包括:(w)使所述一個或多個細(xì)胞暴露于一種或多種錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸,持續(xù)足以使所述錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸將其自身包埋在所述細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)的時間段;和/或(x)使所述一個或多個細(xì)胞暴露于與所述錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸互補(bǔ)的一種或多種標(biāo)記寡核苷酸,持續(xù)足以使所述錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸與所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸形成核酸的互補(bǔ)鏈的時間段;和/或(y)將所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸與所述一種或多種錨-脂質(zhì)修飾的寡核苷酸連接;并任選(z)通過檢測對應(yīng)于所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸的多個獨特核苷酸序列中的一個來檢測所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸的存在。在一些實施方案中,所公開的方法的分離一個或多個細(xì)胞的核酸的步驟包括基于一種或多種標(biāo)記寡核苷酸的存在來分離所述一個或多個細(xì)胞,其中通過檢測對應(yīng)于所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸的多個獨特核苷酸序列中的一個來確定所述一種或多種標(biāo)記寡核苷酸的存在。
9、在一些實施方案中,本公開提供確認(rèn)受試者的組織內(nèi)的核酸的空間表達(dá)模式的方法,所述方法包括:(a)將來自對應(yīng)于所述組織的區(qū)域的樣品的一個或多個細(xì)胞分配到多個容器中的一個中;(b)用包含脂質(zhì)部分、條形碼區(qū)和捕獲序列的脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸使所述一個或多個細(xì)胞暴露,持續(xù)足以使所述脂質(zhì)部分將其自身包埋在所述一個或多個細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)的時間段,其中所述脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸的所述條形碼區(qū)對于所述一個或多個細(xì)胞暴露于其中的所述多個容器之一的每一者是獨特的;(c)對所述一個或多個細(xì)胞中由所述脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸的所述捕獲序列捕獲的核酸進(jìn)行測序;以及(d)根據(jù)包含在所述測序核酸中的每一者中的所述條形碼區(qū)將來自所述一個或多個細(xì)胞的所述測序核酸與所述一個或多個細(xì)胞在所述組織內(nèi)和/或相對于所述組織的空間位置相關(guān)聯(lián)。在一些實施方案中,所公開的方法中使用的脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸包括:(i)包含所述脂質(zhì)部分和第一引物區(qū)的第一脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸;和(ii)包含第二引物區(qū)、條形碼區(qū)和捕獲序列的第二dna寡核苷酸,其中所述第二引物區(qū)是所述第一引物區(qū)的反向互補(bǔ)體。在一些實施方案中,所述第一脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸還包含第一雜交區(qū)。在一些實施方案中,所公開的方法還包括在測序的步驟之前使所述一個或多個細(xì)胞暴露于第二脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸,其中所述第二脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸包含第二雜交區(qū)和第二脂質(zhì)部分,其中所述第二雜交區(qū)是所述第一雜交區(qū)的反向互補(bǔ)體。在一些實施方案中,所公開的方法還包括(e)使所述細(xì)胞暴露于流式細(xì)胞術(shù)。在一些實施方案中,所公開的方法的分配步驟包括將厚度為約0.1至約99微米的所述樣品的組織切片或三維制劑放置到多個容器中的一個中。在一些實施方案中,所公開的方法中使用的所述一個或多個容器是多孔。在一些實施方案中,所公開的方法中使用的樣品是組織切片。
10、在一些實施方案中,本公開的第一脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)從5'至3'取向包含所述第一脂質(zhì)部分、所述第一雜交區(qū)和所述第一引物區(qū)。在其它實施方案中,本公開的第一脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)從3'至5'取向包含所述第一脂質(zhì)部分、所述第一雜交區(qū)和所述第一引物區(qū)。
11、在一些實施方案中,本公開的第二脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)從5'至3'取向包含所述第二雜交區(qū)和所述第二脂質(zhì)部分。在一些實施方案中,本公開的第二脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)從3'至5'取向包含所述第二雜交區(qū)和所述第二脂質(zhì)部分。
12、在一些實施方案中,本公開的第三dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)從5'至3'取向包含所述第二引物區(qū)、所述條形碼區(qū)和所述捕獲序列。在一些實施方案中,本公開的第三dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)從3'至5'取向包含所述第二引物區(qū)、所述條形碼區(qū)和所述捕獲序列。
13、在一些實施方案中,本公開的第一脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)中使用的第一脂質(zhì)部分包含具有約12至約28個碳的脂肪酸。在一些實施方案中,本公開的第二脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)中使用的第二脂質(zhì)部分包含具有約12至約28個碳的脂肪酸。在一些實施方案中,本公開的脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)中使用的第一脂質(zhì)部分和第二脂質(zhì)部分均包含具有約12至約28個碳的脂肪酸。
14、在一些實施方案中,本公開的第一脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)中使用的第一脂質(zhì)部分包含式i的化合物:
15、
16、或其生理學(xué)上可接受的鹽,
17、其中n1是5至25,n2是1至25,且x選自由nh、ch2、o和ch-r組成的組,其中r是c12至c28甘油單酯、烯基、烷基、芳基或芳烷基。在一些實施方案中,所述第一脂質(zhì)部分包含選自由木蠟酸和膽固醇組成的組的脂質(zhì)。在一些實施方案中,所述膽固醇是膽固醇-三甘醇(teg)。
18、在一些實施方案中,本公開的第二脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)中使用的第二脂質(zhì)部分包含式ii的化合物:
19、
20、或其生理學(xué)上可接受的鹽,
21、其中n1是5至25,n2是0至24,且x選自由nh、ch2、o和ch-r組成的組,其中r是c12至c28甘油單酯、烯基、烷基、芳基或芳烷基。在一些實施方案中,所述第二脂質(zhì)部分包含選自由棕櫚酸和膽固醇組成的組的脂質(zhì)。在一些實施方案中,所述膽固醇是膽固醇-三甘醇(teg)。
22、在一些實施方案中,本公開的第三dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)中使用的捕獲序列是聚腺苷酸化區(qū)。
23、在一些實施方案中,本公開的第一脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)包含與seq?id?no:1(gtaacgatcca?gctgtcacttggaattctcgggtgccaagg)的核酸序列具有至少約70%序列同一性的核酸序列。在一些實施方案中,本公開的第二脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)包含與seq?id?no:2(agtgacagctggatcgttac)的核酸序列具有至少約70%序列同一性的核酸序列。在一些實施方案中,本公開的第三dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)包含與seq?id?no:3(ccttggcacccgagaattccannnn?nnaaaaaaaaaaaaaaaaa?aaaaaaaaaaaaaaa)的核酸序列具有至少70%序列同一性的核酸序列。
24、在一些實施方案中,本公開的第一脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)與固體支持物結(jié)合。在一些實施方案中,本公開的第二脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)與固體支持物結(jié)合。在一些實施方案中,本公開的第三脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)與固體支持物結(jié)合。在一些實施方案中,所述第一脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸、所述第二脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸和所述第三脂質(zhì)綴合的dna寡核苷酸中的一者或多者與固體支持物結(jié)合。在一些實施方案中,所述固體支持物是珠粒。在一些實施方案中,本公開的第三dna寡核苷酸(包括所公開的組合物和方法)中使用的捕獲序列包含聚腺苷酸化區(qū),并且所述珠粒包含與所述第三dna寡核苷酸的所述聚腺苷酸化區(qū)雜交的聚(t)區(qū)。