本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種argonaute介導(dǎo)的無引物指數(shù)擴(kuò)增方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、核酸擴(kuò)增技術(shù)作為分子診斷、基因測序及合成生物學(xué)等領(lǐng)域的核心技術(shù)，其發(fā)展歷程始終圍繞如何高效、特異性地擴(kuò)增靶標(biāo)序列展開。傳統(tǒng)技術(shù)如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（lamp）以及重組酶聚合酶擴(kuò)增（rpa）等，雖然在特定場景中展現(xiàn)了實用性，但其核心依賴引物介導(dǎo)的靶標(biāo)識別機(jī)制，導(dǎo)致了一系列難以克服的技術(shù)瓶頸。

2、以pcr技術(shù)為例，其通過高溫變性（95℃）、低溫退火（50–65℃）和中溫延伸（72?℃）的三步循環(huán)實現(xiàn)dna擴(kuò)增，這一過程高度依賴一對特異性引物（通常為18–25?nt）。引物設(shè)計需通過blast工具驗證序列特異性，并嚴(yán)格控制gc含量（40–60?%）以避免二級結(jié)構(gòu)或引物二聚體的形成。然而，引物設(shè)計周期長、錯誤率高，且低豐度靶標(biāo)的擴(kuò)增效率顯著下降。此外，pcr對精密溫控設(shè)備的依賴限制了其在即時檢測（poct）中的應(yīng)用。在covid-19核酸檢測中，盡管pcr被廣泛采用，但病毒基因組的快速變異常導(dǎo)致引物脫靶，迫使設(shè)計頻繁更新，凸顯了引物依賴性技術(shù)的脆弱性。

3、相較于pcr的多溫階循環(huán)，lamp技術(shù)通過鏈置換型dna聚合酶（如bst酶）在恒溫條件（60–65?℃）下實現(xiàn)擴(kuò)增，其核心在于利用4–6條引物（包括內(nèi)引物、外引物及環(huán)引物）識別靶標(biāo)的6–8個區(qū)域，形成環(huán)狀擴(kuò)增產(chǎn)物。然而，lamp的引物設(shè)計復(fù)雜度更高：內(nèi)引物需包含反向互補(bǔ)序列，極易形成二級結(jié)構(gòu)，且依賴專用軟件（如primer?explorer）的設(shè)計容錯率較低（錯配容忍度＜2?nt）。實際應(yīng)用中，引物間交叉反應(yīng)導(dǎo)致的非特異性擴(kuò)增及多重檢測時的信號干擾嚴(yán)重限制了其可靠性。例如，在瘧疾流行區(qū)，lamp雖被用于瘧原蟲18s?rrna基因的檢測，卻因引物設(shè)計難以區(qū)分近緣物種而頻現(xiàn)誤判。

4、rpa技術(shù)則另辟蹊徑，利用重組酶（如t4?uvsx）與長引物（＞30?nt）形成復(fù)合物，在恒溫（37-42?℃）下侵入雙鏈dna并啟動擴(kuò)增。該技術(shù)通過重組酶的鏈交換活性實現(xiàn)靶標(biāo)識別，避免了傳統(tǒng)熱循環(huán)需求。然而，長引物的合成成本高昂（需化學(xué)修飾及hplc純化），且高gc含量易導(dǎo)致重組酶活性喪失。此外，rpa的靈敏度受限于重組酶的熱敏感性，非特異性結(jié)合引發(fā)的背景信號（信噪比＜2）亦需熒光探針輔助判讀。在埃博拉病毒野外檢測中，rpa雖因設(shè)備簡易受到青睞，卻因引物無法快速適配病毒變異而暴露局限性。

5、綜上，傳統(tǒng)技術(shù)的共性缺陷集中于引物依賴性帶來的設(shè)計復(fù)雜性、設(shè)備依賴性與靈敏度限制。pcr的多溫階需求、lamp的多引物設(shè)計負(fù)擔(dān)及rpa的長引物合成成本，均凸顯了引物作為“分子鑰匙”的雙刃劍效應(yīng)——既是靶標(biāo)識別的核心工具，亦是技術(shù)優(yōu)化的主要瓶頸。此外，引物二聚體、非特異性擴(kuò)增及低豐度靶標(biāo)檢測效率低下等問題，進(jìn)一步制約了這些技術(shù)在精準(zhǔn)醫(yī)療和現(xiàn)場檢測中的應(yīng)用。在此背景下，開發(fā)一種無需引物設(shè)計、兼具高靈敏度與特異性的核酸擴(kuò)增技術(shù)，成為突破現(xiàn)有困局的關(guān)鍵方向。

6、ttago（thermus?thermophilus?argonaute）是一種源自革蘭氏陰性嗜熱菌的原核argonaute蛋白，其通過5'磷酸化單鏈引導(dǎo)dna（guide?dna,?gdna）的精準(zhǔn)導(dǎo)向，可在65-85℃高溫條件下實現(xiàn)dna引導(dǎo)的特異性核酸剪切功能。與crispr/cas系統(tǒng)相比，ttago展現(xiàn)出顯著的技術(shù)優(yōu)勢：其一，其作用機(jī)制不受原間隔序列鄰近基序（pam）限制，能夠靶向任意dna序列，而crispr/cas系統(tǒng)需依賴特定pam序列的識別；其二，ttago具備單堿基分辨率的精準(zhǔn)識別能力，對突變位點的空間位置無嚴(yán)格限制，而crispr/cas系統(tǒng)對pam鄰近區(qū)域的堿基錯配高度敏感，極大限制了其在突變檢測中的應(yīng)用范圍；其三，ttago可同時兼容多種gdna引導(dǎo)序列，實現(xiàn)多元靶標(biāo)的并行檢測且無信號串?dāng)_，而部分crispr/cas系統(tǒng)在多靶標(biāo)檢測時易引發(fā)交叉反應(yīng)；其四，ttago具有優(yōu)異的耐高溫特性，在65-85℃范圍內(nèi)維持高效切割活性，通過添加蛋白變性劑（如dtt）可進(jìn)一步優(yōu)化其在低溫環(huán)境（如55℃）下的剪切效率；其五，ttago僅需短鏈gdna（15-20?nt）作為引導(dǎo)分子，相較于crispr/cas系統(tǒng)依賴的長鏈rna引導(dǎo)序列（約100?nt），其制備成本更低且穩(wěn)定性顯著提升。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種argonaute介導(dǎo)的無引物指數(shù)擴(kuò)增方法及其應(yīng)用。

2、第一方面，本發(fā)明要求保護(hù)一種argonaute介導(dǎo)的無引物指數(shù)擴(kuò)增方法。

3、本發(fā)明所要求保護(hù)的argonaute介導(dǎo)的無引物指數(shù)擴(kuò)增方法，可包括如下步驟：

4、（a1）根據(jù)靶標(biāo)序列設(shè)計并合成5'端經(jīng)磷酸化修飾的單鏈引導(dǎo)dna，記作gdna；所述gdna與所述靶標(biāo)序列中部分序列（此處所述部分序列為連續(xù)序列）反向互補(bǔ)；

5、（a2）將具有切割活性的argonaute與（a1）中所得gdna進(jìn)行孵育，得到argonaute/gdna復(fù)合物；

6、（a3）將（a2）中所得argonaute/gdna復(fù)合物與所述靶標(biāo)序列混合，通過反應(yīng)所述argonaute完成對所述靶標(biāo)序列的特異性切割（如ttago的切割位點位于所述gdna的5'?端第10和11個堿基之間的磷酸二酯鍵），并且釋放出被切割單鏈位于切割位點5’端的部分；

7、（a4）向步驟（a3）所得反應(yīng)產(chǎn)物中加入單鏈模板、dna聚合酶、dntps和反應(yīng)緩沖液，得到反應(yīng)體系；

8、所述單鏈模板自5’端到3’端依次由如下三部分組成：

9、第一部分：所述ab鏈的反向互補(bǔ)序列（記作a'b'鏈）；

10、第二部分：所述gdna中位于所述切割位點5’端的核苷酸序列（記作c'鏈，若所述argonaute為ttago，則所述c'鏈為所述gdna的自5’端起第1-10位氨基酸序列）；

11、第三部分：所述ab鏈的反向互補(bǔ)序列（即所述a'b'鏈）。

12、其中，所述第二部分（即所述c'鏈）和所述第三部分（即靠近3’端的所述a'b'鏈）組成的片段上具有與所述gdna完全相同的序列，所以在后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)中，由所述單鏈模板生成的新雙鏈能重復(fù)被所述argonaute/gdna復(fù)合物特異性識別并剪切。

13、將所述反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，實現(xiàn)產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增。

14、在步驟（a4）中，所述ab鏈與所述單鏈模板中的a'b'鏈互補(bǔ)配對，在所述dna聚合酶的作用下延伸形成新雙鏈，所述新雙鏈重復(fù)被所述argonaute/gdna復(fù)合物特異性識別并剪切，釋放出的所述ab鏈、cab鏈（即由所述c'鏈和所述a'b'鏈順次連接后所得序列的反向互補(bǔ)序列）可重新進(jìn)入與所述單鏈模板互補(bǔ)配對，在所述dna聚合酶的作用下延伸形成新雙鏈，自此形成閉合循環(huán)動態(tài)過程，實現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物（即所述ab鏈和所述cab鏈）的指數(shù)累積。

15、進(jìn)一步地，所述單鏈模板的3’端可修飾有c3?spacer等基團(tuán)。目的是封閉3’端，防止非特異性擴(kuò)增。

16、在本發(fā)明的一個實施案例中，步驟（a2）中，所述argonaute為ttago。

17、進(jìn)一步地，步驟（a4）中，所述dna聚合酶可為鏈置換聚合酶。

18、在本發(fā)明的一個實施案例中，所述鏈置換聚合酶為vent?dna聚合酶。

19、進(jìn)一步地，步驟（a2）中，所述孵育可為75℃孵育30min。

20、進(jìn)一步地，步驟（a3）中，所述反應(yīng)可為85℃孵育1h。

21、進(jìn)一步地，步驟（a4）中，所述反應(yīng)的條件可為：55℃?30?s，85℃?45?s，120次循環(huán)。

22、本發(fā)明所要求保護(hù)的argonaute介導(dǎo)的無引物指數(shù)擴(kuò)增方法，可包括如下步驟：

23、前文所述（a1）；

24、前文所述（a2）；以及

25、將前文所述（a3）和前文所述（a4）合并而成的如下步驟（a34）：將（a2）中所得argonaute/gdna復(fù)合物與所述靶標(biāo)序列、所述單鏈模板、所述dna聚合酶、所述dntps和所述反應(yīng)緩沖液混合，得到反應(yīng)體系，將所述反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，實現(xiàn)產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增。

26、進(jìn)一步地，在步驟（a34）中，所述反應(yīng)的條件為：55℃?30?s，85℃?45?s，120次循環(huán)。

27、所述靶標(biāo)序列既可為雙鏈，也可以為單鏈。所述靶標(biāo)序列的長度可為80-120?bp左右或80-120?nt左右。

28、在本發(fā)明的一個實施案例中所述靶標(biāo)序列為長度91?bp的雙鏈dna。所述靶標(biāo)序列具體為由seq?id?no.1所示正向鏈和seq?id?no.2所示反向鏈反向互補(bǔ)形成的雙鏈dna。相應(yīng)地，所述gdna的序列如seq?id?no.3所示（5’端經(jīng)磷酸化修飾）。所述ab鏈的序列如seq?idno.4所示。所述單鏈模板的序列如seq?id?no.7所示（3’端修飾有c3?spacer基團(tuán)）。

29、在本發(fā)明的一個實施案例中，步驟（a2）中進(jìn)行所述孵育的體系中含有0.33μm的ttago和1.67μm?gdna，以及10mm的mg2+以及反應(yīng)緩沖液（如10×thermopol反應(yīng)緩沖液），余量為水。步驟（a3）的反應(yīng)體系是向上述步驟（a2）反應(yīng)后的體系中加入所述靶標(biāo)序列和反應(yīng)緩沖液（如10×thermopol反應(yīng)緩沖液）以及水后所得，其中上述步驟（a2）反應(yīng)后的體系占6/10的體積比，所述靶標(biāo)序列的濃度為100nm。步驟（a4）的反應(yīng)體系是向上述步驟（a3）反應(yīng)后的體系中加入所述單鏈模板、所述dna聚合酶、所述dntps、所述反應(yīng)緩沖液（如10×thermopol反應(yīng)緩沖液）、sybr?green?i以及水后所得，其中，所述單鏈模板的終濃度為0.1μm，所述dna聚合酶的終濃度為0.1u/μl，所述dntps的終濃度為0.25?mm，所述ttago的終濃度為0.1μm，所述gdna的終濃度為0.5μm。

30、在本發(fā)明的另一個實施案例中，步驟（a34）中的所述反應(yīng)體系是向上述步驟（a2）反應(yīng)后的體系中加入所述靶標(biāo)序列、所述單鏈模板、所述dna聚合酶、所述dntps、所述反應(yīng)緩沖液（如10×thermopol反應(yīng)緩沖液）、sybr?green?i以及水后所得，其中，所述靶標(biāo)序列的濃度為1nm，所述單鏈模板的終濃度為0.1μm，所述dna聚合酶的終濃度為0.1u/μl，所述dntps的終濃度為0.25?mm，所述ttago的終濃度為0.1μm，所述gdna的終濃度為0.5μm。

31、第二方面，本發(fā)明要求保護(hù)前文第一方面中所述方法在檢測靶標(biāo)序列是否發(fā)生突變中的應(yīng)用。

32、進(jìn)一步地，所述突變可為單堿基或多堿基的插入或缺失或替換；所述多堿基為兩個以上（含兩個）堿基。

33、第三方面，本發(fā)明要求保護(hù)一種檢測待測靶標(biāo)序列是否發(fā)生特定突變的方法。

34、本發(fā)明要求保護(hù)的檢測待測靶標(biāo)序列是否發(fā)生特定突變的方法，可包括如下步驟：

35、（b1）根據(jù)發(fā)生特定突變的突變后靶標(biāo)序列設(shè)計并合成5'端經(jīng)磷酸化修飾的單鏈引導(dǎo)dna，記作gdna；所述gdna與所述突變后靶標(biāo)序列中的部分序列（此處所述部分序列為連續(xù)序列）反向互補(bǔ)；所述部分序列包括所述特定突變位置處的核苷酸；

36、（b2）將具有切割活性的argonaute與（b1）中所得gdna進(jìn)行孵育，得到argonaute/gdna復(fù)合物；

37、（b3）將（b2）中所得argonaute/gdna復(fù)合物與待測靶標(biāo)序列混合，在特定溫度下進(jìn)行孵育；所述特定溫度為所述argonaute能夠發(fā)揮切割活性的溫度；

38、（b4）向步驟（b3）處理后的體系中加入單鏈模板、dna聚合酶、dntps和反應(yīng)緩沖液，得到反應(yīng)體系；

39、所述單鏈模板自5’端到3’端依次由如下三部分組成：

40、第一部分：ab鏈的反向互補(bǔ)序列（記作a'b'鏈）；所述ab鏈為（b2）中所得argonaute/gdna復(fù)合物特異性切割所述突變后靶標(biāo)序列（ttago的切割位點位于所述gdna的5'?端第10和11個堿基之間的磷酸二酯鍵）被切割單鏈位于切割位點5’端的部分；

41、第二部分：所述gdna中位于所述切割位點5’端的核苷酸序列（記作c'鏈，若所述argonaute為ttago，則所述c'鏈為所述gdna的自5’端起第1-10位氨基酸序列）；

42、第三部分：所述ab鏈的反向互補(bǔ)序列（即所述a'b'鏈）。

43、其中，所述第二部分（即所述c'鏈）和所述第三部分（即靠近3’端的所述a'b'鏈）組成的片段上具有與所述gdna完全相同的序列。

44、將所述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；反應(yīng)過程中監(jiān)測是否發(fā)生產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增，然后按照如下確定所述待測靶標(biāo)序列是否發(fā)生了所述特定突變：若發(fā)生產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增，則所述待測靶標(biāo)序列發(fā)生或候選發(fā)生了所述特定突變，若未發(fā)生產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增，則所述待測靶標(biāo)序列未發(fā)生或候選未發(fā)生所述特定突變。

45、在該方法中，由于ttago具有單堿基分辨率（即ttago對gdna與靶標(biāo)序列的互補(bǔ)配對要求極高，僅當(dāng)兩者完全匹配時才能激活切割活性。單個堿基錯配會導(dǎo)致切割效率顯著下降甚至完全失效），因此：若所述待測靶標(biāo)序列發(fā)生了所述特定突變，則根據(jù)所述突變后靶標(biāo)序列設(shè)計的gdna與ttago形成復(fù)合物后，其能夠特異性識別并切割所述突變后靶標(biāo)序列，進(jìn)而實現(xiàn)后續(xù)的產(chǎn)物指數(shù)擴(kuò)增；而對于未發(fā)生所述特定突變的序列則不能有效識別和切割，最終致使整個過程無法實現(xiàn)產(chǎn)物的指數(shù)累積。

46、進(jìn)一步地，所述單鏈模板的3’端可修飾有c3?spacer等基團(tuán)。目的是封閉3’端，防止非特異性擴(kuò)增。

47、在本發(fā)明的一個實施案例中，步驟（b2）中，所述argonaute為ttago。

48、進(jìn)一步地，步驟（b4）中，所述dna聚合酶可為鏈置換聚合酶。

49、在本發(fā)明的一個實施案例中，所述鏈置換聚合酶為vent?dna聚合酶。

50、進(jìn)一步地，步驟（b2）中，所述孵育可為75℃孵育30min。

51、進(jìn)一步地，步驟（b3）中，所述反應(yīng)可為85℃孵育1h。

52、進(jìn)一步地，步驟（b4）中，所述反應(yīng)的條件可為：55℃?30?s，85℃?45?s，120次循環(huán)。

53、本發(fā)明要求保護(hù)的檢測待測靶標(biāo)序列是否發(fā)生特定突變的方法，可包括如下步驟：

54、前文所述（b1）；

55、前文所述（b2）；以及

56、將前文所述（b3）和前文所述（b4）合并而成的如下步驟（b34）：將（b2）中所得argonaute/gdna復(fù)合物與所述待測靶標(biāo)序列、所述單鏈模板、所述dna聚合酶、所述dntps和所述反應(yīng)緩沖液混合，得到反應(yīng)體系，將所述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；反應(yīng)過程中監(jiān)測是否發(fā)生產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增，然后按照如下確定所述待測靶標(biāo)序列是否發(fā)生了所述特定突變：若發(fā)生產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增，則所述待測靶標(biāo)序列發(fā)生或候選發(fā)生了所述特定突變，若未發(fā)生產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增，則所述待測靶標(biāo)序列未發(fā)生或候選未發(fā)生所述特定突變。

57、進(jìn)一步地，在步驟（b34）中，所述擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：55℃?30?s，85℃?45?s，120次循環(huán)。

58、進(jìn)一步地，步驟（b4）和步驟（b34）中，所述監(jiān)測是否發(fā)生產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增可通過如下實現(xiàn)：進(jìn)行反應(yīng)前向所述反應(yīng)體系中同時加入熒光染料；

59、進(jìn)一步地，所述熒光染料為sybr?green?i。

60、進(jìn)一步地，所述靶標(biāo)序列既可為雙鏈，也可以為單鏈。所述靶標(biāo)序列的長度可為80-120?bp或80-120?nt。

61、在本發(fā)明的一個實施案例中所述靶標(biāo)序列為長度91?bp的雙鏈dna。所述靶標(biāo)序列具體為由seq?id?no.1所示正向鏈和seq?id?no.2所示反向鏈反向互補(bǔ)形成的雙鏈dna。相應(yīng)地，所述gdna的序列如seq?id?no.3所示（5’端經(jīng)磷酸化修飾）。所述ab鏈的序列如seq?idno.4所示。所述單鏈模板的序列如seq?id?no.7所示（3’端修飾有c3?spacer基團(tuán)）。

62、進(jìn)一步地，所述gdna的長度為16-25nt。在本發(fā)明的一個實施案例中，所述gdna的長度為17nt。

63、進(jìn)一步地，所述ab鏈的長度為15-19nt。在本發(fā)明的一個實施案例中，所述ab鏈的長度為19nt。

64、在本發(fā)明的一個實施案例中，步驟（b2）中進(jìn)行所述孵育的體系中含有0.33μm的ttago和1.67μm?gdna，以及10mm的mg2+以及反應(yīng)緩沖液（如10×thermopol反應(yīng)緩沖液），余量為水。步驟（b3）的反應(yīng)體系是向上述步驟（b2）反應(yīng)后的體系中加入所述靶標(biāo)序列和反應(yīng)緩沖液（如10×thermopol反應(yīng)緩沖液）以及水后所得，其中上述步驟（b2）反應(yīng)后的體系占6/10的體積比，所述靶標(biāo)序列的濃度為100nm。步驟（b4）的反應(yīng)體系是向上述步驟（b3）反應(yīng)后的體系中加入所述單鏈模板、所述dna聚合酶、所述dntps、所述反應(yīng)緩沖液（如10×thermopol反應(yīng)緩沖液）、sybr?green?i以及水后所得，其中，所述單鏈模板的終濃度為0.1μm，所述dna聚合酶的終濃度為0.1u/μl，所述dntps的終濃度為0.25?mm，所述ttago的終濃度為0.1μm，所述gdna的終濃度為0.5μm。

65、在本發(fā)明的另一個實施案例中，步驟（b34）中的所述反應(yīng)體系是向上述步驟（b2）反應(yīng)后的體系中加入所述靶標(biāo)序列、所述單鏈模板、所述dna聚合酶、所述dntps、所述反應(yīng)緩沖液（如10×thermopol反應(yīng)緩沖液）、sybr?green?i以及水后所得，其中，所述靶標(biāo)序列的濃度為1nm，所述單鏈模板的終濃度為0.1μm，所述dna聚合酶的終濃度為0.1u/μl，所述dntps的終濃度為0.25?mm，所述ttago的終濃度為0.1μm，所述gdna的終濃度為0.5μm。

66、第四方面，本發(fā)明要求保護(hù)如下任一試劑盒：

67、（c1）一種用于進(jìn)行argonaute介導(dǎo)的無引物指數(shù)擴(kuò)增的試劑盒，含有前文第一方面中所述的gdna、所述的argonaute、所述的單鏈模板和所述的dna聚合酶。

68、（c2）一種用于檢測待測靶標(biāo)序列是否發(fā)生特定突變的試劑盒，含有前文第三方面中所述的gdna、所述的argonaute、所述的單鏈模板、所述的dna聚合酶和所述的熒光染料。

69、進(jìn)一步地，所述試劑盒中還可含有擴(kuò)增緩沖液和dntps。

70、實驗證明，本發(fā)明構(gòu)建了基于ttago蛋白的內(nèi)源引物驅(qū)動型擴(kuò)增體系：ttago/gdna復(fù)合物通過靶向剪切靶標(biāo)dna釋放初始的功能性內(nèi)源引物鏈；該引物與外源加入的單鏈模板互補(bǔ)引導(dǎo)聚合酶延伸生成雙鏈結(jié)構(gòu)，熱循環(huán)（解鏈-退火-延伸）驅(qū)動擴(kuò)增產(chǎn)物累積的同時，觸發(fā)ttago對新生雙鏈的二次切割及引物再生，釋放的引物反饋至擴(kuò)增級聯(lián)，形成剪切-延伸耦聯(lián)的自持性循環(huán)系統(tǒng)。sybr?green?i實時熒光定量分析證實，該體系實現(xiàn)了dna產(chǎn)物的指數(shù)合成。

71、本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)，具有如下優(yōu)勢：（1）本發(fā)明徹底摒棄外源引物設(shè)計，內(nèi)源引物自動生成。利用ttago/gdna復(fù)合物直接識別并切割靶標(biāo)獲得引物，徹底消除引物設(shè)計、合成與驗證環(huán)節(jié)。（2）本發(fā)明零引物二聚體與非特異性風(fēng)險。ttago的靶向切割與vent?dna聚合酶的校正活性（3'→5'?exonuclease）協(xié)同作用形成雙重特異性保障。（3）本發(fā)明使用指數(shù)級自驅(qū)動擴(kuò)增，實現(xiàn)產(chǎn)物2n累積，擴(kuò)增效率穩(wěn)定；鏈置換高效解旋，vent?dna聚合酶持續(xù)合成能力克服模板二級結(jié)構(gòu)，靈敏度提高。（4）本發(fā)明兼容snp、插入/缺失突變，無需重新設(shè)計引物。后續(xù)可以應(yīng)用于擴(kuò)增檢測試劑盒，避免假陽性，提高檢出率。

72、總之，本發(fā)明通過內(nèi)源引物自生成機(jī)制，解決了傳統(tǒng)技術(shù)中引物設(shè)計復(fù)雜、非特異性干擾嚴(yán)重等核心問題。argonaute蛋白與鏈置換聚合酶的協(xié)同作用，實現(xiàn)了無需引物的指數(shù)擴(kuò)增，為分子診斷、環(huán)境監(jiān)測及合成生物學(xué)提供了標(biāo)準(zhǔn)化、低成本的技術(shù)平臺。